基于核酸短暂杂交和Lambda核酸外切酶的单碱基突变检测方法的研究

发布时间：2020-07-01 18:30

【摘要】：DNA动态过程的精确设计依赖于生物物理学方法和动态DNA纳米技术。作为最简单的动态DNA结构,短DNA双链(9-12 nt)构成短暂杂交方式,可用于超分辨成像和体外检测。核酸底物上的核酸酶活性使得在分析化学和动态DNA纳米技术中的各种应用成为可能。核酸外切酶在细胞生物学中起着至关重要的作用,并以准确的方式操控核酸。研究动态底物与核酸外切酶的相互作用有助于开发新的方法来设计特殊的分子行为并将动态DNA纳米技术转移到活细胞中。Lambda核酸外切酶不仅用于PCR产物处理,也是DNA分析方法与纳米技术的衡量工具,由于其对错配的敏感性而受到广泛应用,然而其单核苷酸选择性并不高,受DNA纳米技术中用于提高特异性的动态探针的启发,我们将荧光测验和单分子荧光分析相结合,利用Lambda核酸外切酶来探究它对短双链DNA的单碱基选择性。荧光测量结果表明,即使长度小于酶足迹,短dsDNA也可被有效地消化,并且降解速率表现出高的单核苷酸选择性。单分子分析表明,完全匹配(PM)底物可以有选择性的结合酶,其与短底物短暂杂交的差异稳定性结合以产生高的单核苷酸选择性。单分子分析表明DNA短暂杂交和酶结合两个平衡过程决定非平衡的消化过程,这两种方法的协同作用提供了高的单核苷酸选择性。本实验利用底物-酶相互作用,开发了一种高度选择性的单核苷酸突变检测方法,可以从低丰度的细胞系中检测到KRAS突变,该方法能够检测到的突变低至0.1%。
【学位授予单位】：北京化工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R440;O657.3
【图文】：

如先前报道的，由于错配位置不同，短的双链ＤＮＡ的平衡常数可以从１０２变逡逑化至１０５ｎＭ。首先经过ＮＵＰＡＣＫ软件预分析，我们选定了邋４个位置来进行错配位点逡逑的修改，我们在１２－ｂｐ邋ＰＭ底物的不同位置引入了邋Ｃ：Ａ错配。从图２－２的ＤＦ值我们可逡逑以看出当错配位于不同位置时，发现不同的ＤＦ值。位于中间的错配动态底物表现出逡逑最低的反应速率。通过将错配转移到最后，催化活性逐渐复。这一结果与先前的观察逡逑结果一致，即当接近双链体中部时，错配对双链体稳定性有更大的负面影响。虽然核逡逑酸外切酶的催化活性可能对错配附近的碱基敏感，但区分度因错配位置不同而不同，逡逑主要由双链体稳定性的变化引起。本实验探究了不同位点单碱基突变对于短暂杂交体逡逑系区分度的影响，第９位的突变区分度优于其他位点，因此我们后续实验将以第９位逡逑点突变开展探究。逡逑１４逡逑

活性的动力学都可以通过一价和二价阳离子进行调节。由于寡核苷酸是聚阴离子的，逡逑加入阳离子（例如Ｎａ＋，邋Ｍｇ２。可以增强两条链之间的结合力。ＮａＣｌ通常用于调节逡逑ＤＮＡ双链体的稳定性，因此我们研宄了邋ＮａＣｌ对单核苷酸鉴别能力的影响。如图２－４，逡逑体系中ＮａＣｌ终浓度分别为ＯｍＭ、１０ｍＭ、５０ｍＭ、１００ｍＭ，我们看到在没有盐离逡逑子存在的情况下，两个靶信号探针双链体的稳定性较弱，而ＮａＣｌ的引入对于区分度逡逑的提高有很多大帮助，５０ｍＭＮａＣｌ的引入使得区分度能上升到１０００以上，完全互补逡逑型与错配型双链的降解速率都增加，这主要是由于随着溶液离子强度的增加，完全互逡逑补型的双链体相比于错配型的信号增加得更多，因此它们之间的ＤＦ值进一步增加。逡逑除此之外，我们从图２－４中看出，１００邋ｍＭ邋ＮａＣｌ调节的体系的ＤＦ值降低，因为高浓逡逑度ＮａＣｌ对酶的活性产生了影响，从而导致ＤＦ的降低，因此我们选取５０邋ｍＭ邋ＮａＣｌ逡逑作为体系离子调节来进行后续实验。逡逑１６逡逑

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本文编号：2737118