TLR4对脓毒症调节性T细胞功能活性的影响及机制的初步探讨

发布时间：2020-07-03 10:16

【摘要】：目的:研究Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)在脓毒症中对炎症反应的作用及其对调节性T细胞(Treg)功能活性的影响,并探讨其作用机制。方法:1.脓毒症状态下TLR4对小鼠炎症反应的作用:SPF级C57/BL雄性小鼠(Wild type,WT)40只,TLR4基因敲除(TLR4~(-/-))小鼠40只,采用随机数字表法随机分为四组,WT Sham组(n=20),WT CLP组(n=20),TLR4~(-/-)Sham组(n=20),TLR4~(-/-)CLP组(n=20)。小鼠在实验开始前适应性饲养1周,室温在24℃左右,湿度在45%左右,每天12h光照维持昼夜循环,自由进食水。术前12h禁食、4h禁水。CLP组(包括WT CLP组和TLR4~(-/-)CLP组)用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型,Sham组(包括WT Sham组和TLR4~(-/-)Sham组)为假手术组。观察术后小鼠一般状态及24h,48h,72h小鼠存活率。健康C57BL6雄性小鼠及同种别TLR4基因敲除小鼠各20只,随机分为对照组(Sham组)、CLP组、TLR4~(-/-)对照组、TLR4~(-/-)CLP组,各组小鼠10只,重新建立CLP模型。术后24h断颈处死存活小鼠,采用苏木素-伊红染色观察肺脏病理学改变,ELISA检测小鼠外周血中的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平。2.TLR4在脓毒症中对Treg功能活性的影响:SPF级C57/BL雄性小鼠(Wild type,WT)40只,TLR基因敲除(TLR4~(-/-))小鼠40只,采用随机数字表法随机分为四组,WT Sham组(n=20),WT CLP组(n=20),TLR4~(-/-)Sham组(n=20),TLR4~(-/-)CLP组(n=20),小鼠在实验开始前适应性饲养1周,室温在24℃左右,湿度在40%左右,每天12h光照维持昼夜循环,正常进食水。手术前12h禁食,4h禁水。CLP组用盲肠结扎穿孔法制备脓毒症模型,Sham组为假手术组。术后24h断颈处死存活小鼠,实时荧光定量RT-PCR方法检测各组小鼠脾脏CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞内Foxp3~+mRNA、TLR4mRNA的表达,流式细胞术检测各组小鼠脾脏CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞比例、凋亡率及其Foxp3、CTLA-4、TLR4表达情况,Western blot检测Treg细胞内NF-κB、p65蛋白的表达量;将分离出来的CD4~+CD25~+Foxp3~+Treg细胞与CD4~+CD25~-T细胞共培养24h后,分离上清液,用ELISA检测上清液中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平。结果:1.脓毒症状态下TLR4对小鼠炎症反应的影响1.1 WT Sham组及TLR4~(-/-)Sham组小鼠假手术后,活动较术前无明显异常,呼吸如常,正常饮水,大小便如常,对外界刺激反应较前无明显变化。WT CLP组小鼠在手术后,活动较前明显减少,嗜睡,呼吸加深加快,被毛凌乱无光泽、竖毛、寒战,饮水进食减少,对外界刺激反应差等症状,腹腔有积液。TLR4~(-/-)CLP组小鼠手术后,活动较前减少,呼吸加深加快,被毛凌乱但有光泽,仅部分出现竖毛、寒战,进食减少、饮水正常,对外界刺激反应变慢。1.2 WT Sham组及TLR4~(-/-)Sham组小鼠24h、48h、72h内小鼠无死亡,72h存活率为100%。WT CLP组小鼠24h、48h、72h存活率分别为80%、50%、40%。TLR4~(-/-)CLP组小鼠24h、48h、72h存活率分别为90%、70%、60%。1.3 Sham组肺脏无明显异常,WT CLP组较TLR4~(-/-)CLP组肺间质明显增宽,肺组织伴有充血、出血及大量中性粒细胞及巨噬细胞浸润,同时,血管周围间隙增大。1.4与Sham组比较,WT CLP组及TLR4~(-/-)CLP组的IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α水平显著升高(P0.05)。与WT CLP组相比,TLR4~(-/-)CLP组IL-2、TNF-α水平显著升高(P0.05),IL-4、IL-10的水平则显著降低(P0.05)。2.脓毒症状态下TLR4对Treg功能及活性的影响2.1 WT CLP组较TLR4~(-/-)CLP组及Sham组Treg细胞CTLA-4、Foxp3表达显著升高(P0.05),相较于TLR4~(-/-)CLP组及Sham组小鼠,WT CLP组Treg细胞TLR4表达明显升高。2.2 CLP组较Sham组小鼠脾脏内Treg细胞内Foxp3mRNA、TLR4mRNA水平明显升高(P0.05)。TLR4~(-/-)CLP组小鼠较WT CLP组Foxp3mRNA、TLR4mRNA水平显著降低(P0.05)。2.3 CLP组Treg细胞凋亡较Sham组明显减少(P0.05);同时,Treg细胞比例显著高于Sham组(P0.05)。TLR4~(-/-)CLP组Treg细胞凋亡较WT CLP组增多(P0.05),Treg比例明显降低(P0.05)。2.4 CD4~+CD25~-T细胞与Treg共培养后,相较于与WT CLP组,TLR4~(-/-)CLP组IL-2、TNF-α的水平明显较高(P0.05),而IL-4、IL-10的水平则显著降低(P0.05)。2.5 WT CLP组小鼠Treg细胞内TLR4、NF-κB、p65的表达水平明显高于TLR4~(-/-)CLP组及Sham组小鼠(P0.05)。结论:1.脓毒症中TLR4基因敲除可减少炎症因子的分泌,减轻小鼠组织炎症反应,减少过度炎症反应对机体造成的损伤,提高存活率。2.脓毒症中TLR4与Treg细胞功能的异常活化密切相关。3.该效应机制可能与TLR4/NF-κB信号通路影响Treg细胞功能及活性有关。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
【图文】：

各组小鼠术后生存曲线

小鼠,小鼠细胞因子,水平比较,浓度

图 2.各组小鼠肺组织病理学形态改变.3.3 小鼠外周血 IL-2、IL-4、IL-10 及 TNF-α 水平如图 3，与 WT Sham 组相比，TLR4-/-Sham 组小鼠外周血中 IL-2、IL-4、IL-NF-α 水平无明显差异（P>0.05）。与 WT Sham 组比较，WT CLP 组的 IL-2、IL-10、TNF-α 水平明显升高（P<0.05）。与 WT CLP 组相比，TLR4-/-CLP 组 ILNF-α 浓度明显升高（P<0.05），IL-4、IL-10 的浓度则明显减低（P<0.05）。表 1：各小组小鼠细胞因子水平比较组 TNF-α(pg/ml) IL-2(pg/ml) IL-4(pg/ml) IL-10(pg/ml)T Sham 63.797±10. 436 41.842±9.290 127.014±22.461 56.220±11.634T CLP 297.913±38.123a74.911±11.253a565.247±114.447a149.548±17.936aLR4-/-Sham 82.862±10.344 60.760±11.209 194.069±47.676 47.826±7.497

【参考文献】