纸基原位生长蛋白—磷酸锰杂化材料及其在生物分析中的应用

发布时间：2020-07-10 02:24

【摘要】：随着人们健康观念的提升,疾病诊断的灵敏性与时效性变得愈发重要。即时诊断技术Point of care(POCT),指在不受时间、地点限制的条件下,实现医学样本的快速检测分析。微流控芯片是现代医学检测的重要工具,利用集成于芯片上的微反应器和微检测设备,仅需少量的液体,即可完成相对快速准确的实验分析。其中,纸基微流控芯片加工简便、成本低廉,可与酶催化显色反应结合,通过可视化信号实现快速诊断,从而摆脱对专业仪器的依赖。但是纸芯片的功能相对单一,研究者希望利用多样化的材料对纸芯片进行修饰,克服这一限制。酶和探针蛋白的有效固定直接影响纸基生物芯片的性能。而纳米材料以其独特形貌、催化性能及生物相容性,为提高生物分子的有效固定,构建高特异性和高灵敏度的生物芯片提供了新的方向。本文创新性地在纸纤维上原位生长蛋白-无机材料杂化物,固定蛋白探针,实现对免疫球蛋白SIgA的检测。进一步挖掘无机纳米材料的催化性能,将人造酶和天然酶直接组装到纤维上,实现对葡萄糖的快速、灵敏、低成本的检测。此外,为了使纸芯片的使用更加简便、高效,又研发了移液器枪头与纸芯片结合的装置用于生物化学检测。本论文的主要研究内容如下:1.纸基原位生长protein G-无机杂化材料检测分泌型免疫球蛋白A(SIgA)分泌型SIgA(SSIgA)是机体粘膜防御系统的主要成分。呼吸道分泌液中SSIgA含量的升高,提示病原体的侵袭。本部分工作结合protein G能特异性与抗体分子的Fc段结合的生物学特性,设计了protein G-无机杂化材料,实现抗体在纸基芯片的定向固定,提高基于纸基的SSIgA免疫检测的灵敏度。本研究通过对不同类型的纸类基底材料的非特异性吸附对比,选择聚酯纤维作为基底材料。随后将无机溶液(MnSO_4)和蛋白溶液(protein G)依次滴加到纸类基底材料,原位合成有机-无机杂化材料。优化protein G的浓度与用量,实现快速在纸基纤维上原位生长protein G-无机杂化材料。通过与试管中液相合成蛋白-无机杂化材料的方法进行比较,发现直接滴加反应液到纸基纤维网络原位生长杂化材料可以显著提高生物分子的利用效率,避免生物分子的浪费;此外,通过移液管对液体的精准操作,为后续免疫反应提高了稳定性和重现性。protein G与抗体Fc段结合,使抗体结合的关键部位Fab功能区面向待检物加入的方向。并纸为固相基底,进行酶联免疫吸附试验(ELISA),检测样品中SSIgA的含量。可视化结果显示,肉眼可见的最低SSIgA浓度为1 ng/mL,达到了基于酶标仪分析的ELISA试剂盒的检测线。基于低成本纸基的免疫分析得益于原位生长protein G无机杂化材料,其有效固定的protein G通过抗体的定向固定,为免疫反应提供了可进行抗原识别的抗体功能区(Fab片段)。更为重要的是,基于纸基的灵敏蛋白分析,摆脱了对专用设备的依赖,为POCT应用打下基础。2.基于纸基原位生长酶-Mn_3(PO_4)_2杂化材料用于可视化检测葡萄糖锰是一种变价金属,研究发现以锰为基础的纳米材料,可被赋予独特的催化活性。在蛋白-无机杂化材料中,Mn_3(PO_4)_2的功能值得深入挖掘。为了进一步探索杂化材料中无机部分的催化活性,用牛血清蛋白(BSA)合成BSA-Mn_3(PO_4)_2,通过优化磷酸根的浓度,获得具有过氧化物酶活性的BSA-Mn_3(PO_4)_2,展示了蛋白-无机物杂化材料除了蛋白固定的功能外的另一独特性能。以此为基础,在纸基上原位合成了葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase,GOx)-Mn_3(PO_4)_2(GOx-Mn_3(PO_4)_2),通过在Whatman?滤纸上依次滴加0.1M硫酸锰和含有酶的磷酸二氢钾生成GOx-Mn_3(PO_4)_2杂化材料用于检测葡萄糖。通过优化酶的浓度和过氧化物酶的底物(3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine,TMB)用量,构建了基于酶-Mn_3(PO_4)_2杂化材料的葡萄糖纸基芯片。考察了纸基芯片的灵敏度、稳定性、分析重复性和特异性等性能,结果显示原位生长酶-Mn_3(PO_4)_2的纸基芯片检测葡萄糖时肉眼可见的最低检出限为0.1 mM,不仅能特异性的检测葡萄糖而且分析重复率为95%-105%。其灵敏的检测得益于原位生长酶-Mn_3(PO_4)_2杂化物:生物酶(GOx)在氧化生物分子(葡萄糖)的过程中生成过氧化氢(H_2O_2)。后者即刻被杂化物中的Mn_3(PO_4)_2催化还原,并氧化TMB底物。由于酶-Mn_3(PO_4)_2杂化物中,生物酶和拟酶结合紧密,减少了反应中间产物扩散的距离,提高了反应效率。为了展示其在真实病理样品中的运用,对真实病理血清样品中的葡萄糖进行监测,并与商品化的试纸条和葡萄糖仪的检测结果进行对比。结果展示了原位生长酶无机杂化材料的纸芯片具有真实情况下运用的潜力。3.结合纸基微流控芯片和移液枪头设计的快速检测装置即时诊断中会涉及到病原物或感染性样品的检测,为了避免具有潜在危害的生物污染,检测分析尽量在封闭的条件下进行。而普通纸基多为开放式,使用时具有一定的风险。针对这一问题,本研究将纸基微流控芯片与标准的移液枪头结合,建立一个快速、安全和无污染的检测装置。利用移液枪的吸液过程完成进液,三棱柱型的纸芯片放入到移液枪头的合适位置,实现3种样品同时且互不干扰的检测。移液枪头的吸液过程准确的将待测样品转移到纸带上,通过可视化的信号得到检测结果。通过同时检测人工尿液中葡萄糖,蛋白质和pH测定了这种装置多样品检测的能力。因此该器件制作简单,使用方便,可以用于生物和化学实验。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：O657;R44
【图文】：

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第 1 章绪论纸基微流控芯片微流控芯片基微流控芯片的原则是通过前处理将纸纤维分为亲水的疏水线之间的区域作为流动通道，流体由于毛细穿过疏水线，即形成了微流体通道。我们常用的制作有：石蜡打印[44; 45]、喷墨打印[46]、绘图法、切割法、激网印刷[49]等。光刻法指利用传统的光刻法完成光刻种各样的图案。绘图法指的是利用绘图仪在滤纸上形电脑控制的 X-Y Knife Plotter 切割纸或者硝酸纤维膜.1[43]，利用切割法制作了形状各异的 2D 纸芯片。

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图 1.2 3D 纸基微流控芯片[52; 53]。(I)3D 纸基微流控芯片的图示。(II)纸基芯片的展开图示1.2.2 纸基微流控芯片在生物分析中的运用纸基微流控芯片可将多个分析检测部分集成于一张纸芯片上。纸芯片具有制作简单、成本低廉和分析时间短等优点，使其广泛的运用于生物分析领域。到目前为此，临床上尿液、泪液以及血液中多种分析物的检测在纸基微流控芯片上成功运用。最常见的包括葡萄糖[31; 54; 55]、蛋白质[55]、尿酸[56]、乳酸[57]、胆固醇[58]以及免疫分子[59]等。1.2.3 纸基微流控芯片几种常用的检测手段纸基芯片常用的检测手段主要有比色检测法、电化学检测法、荧光法、电化学发光法和基于纳米颗粒的检测方法等。其中，比色检测法、电化学检测法和基于纳米颗粒的方法在纸基微流控芯片中最为常用。

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【参考文献】