结核分枝杆菌耐多药突变的高灵敏检测

发布时间：2020-07-10 17:18

【摘要】：结核病是危害人类生命健康的全球性公共卫生问题,耐药结核病的广泛流行给结核病的预防与控制带来了重大的挑战。快速检测耐多药结核病(结核分枝杆菌至少对异烟肼和利福平耐药)对临床用药具有重要的指导意义。结核分枝杆菌的异质性耐药是指在一份结核患者样本中,同时携带敏感型菌和耐药型菌,对它的诊断需要建立一种高灵敏的检测方法。本论文利用可以检测低比例突变的DeepMelt方法,建立了结核分枝杆菌利福平耐药突变和耐多药突变的高灵敏检测体系。第一章,首先简述了结核病的流行概况、结核病的预防与控制、抗结核药物的分类、耐药结核病的诊断和治疗,然后介绍了结核分枝杆菌异质性耐药的特点和检测要求,接着描述了多色熔解曲线分析技术检测突变的原理和自淬灭探针的荧光标记与修饰方法,最后提出了本论文的研究内容。第二章,以利福平耐药基因为研究对象,基于多色熔解曲线分析技术,建立了单管四色利福平耐药突变的高灵敏检测体系,实现了对利福平耐药决定区域(Rifampicin resistance determining region,RRDR)内突变的检测。为保证四条探针对RRDR区域的全覆盖检测,我们深入探究了探针的荧光/淬灭基团的修饰方式、排布和熔点等影响因素,提出了一种新颖的探针设计方案。我们使用质粒参考品考察体系的分析性能,高频突变rpoB 531TCGTTG异质性耐药检出能力为1%突变,rpoB 526CACGAC、rpoB516GACGGC和 rpoB 511CTGCCG 的异质性耐药检出能力分别为5%、10%和20%。最后,利用450份标本对体系的临床性能进行评价,以药敏试验结果为标准,体系的灵敏度为93.84%,特异性为92.76%,Kappa值为0.85,说明本体系与药敏试验结果的一致性强,适合临床应用。第三章,利用DeepMelt技术,建立了结核分枝杆菌耐多药突变的高灵敏检测体系,实现了对异烟肼耐药突变(katG315密码子、inhA启动子和ahpC启动子)和RRDR区域突变的检测。对8个常见突变位点的异质性耐药参考品进行检测,结果显示,高频突变位点rpoB531TCGTTG和katG315AGCACC的检测水平低至 l%,rpoB526CACGAC、rpoBB516GACGGC、inhA promoter-15CT、ahpC promoter-30CT 和 ahpC promoter-10CT 的检测水平为 5%,rpoB 511CTGCCG的检测水平为10%。最后,本研究收集了沈阳、北京、河南、广州四家临床单位共1230份临床标本进行多中心临床评价,以药敏试验结果为标准,对利福平与异烟肼耐药检测的灵敏度分别为95.67%、89.66%,特异性分别为94.27%、95.48%,Kappa值分别为0.875、0.85,整体耐多药符合率为91.02%,本研究建立的耐多药检测体系简便快速、灵敏特异,且易于使用,有望应用于临床耐多药结核的快速诊断。
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R446.5
【图文】：

路径图,路径图,结核病,结核分枝杆菌

１．３结核病的预防与控制逡逑呼吸道感染是结核的主要感染途径，飞沫感染是最主要的感染方式［２７］，其感逡逑染路线如图１－３所示，含有结核分枝杆菌的微滴能够到达人体的呼吸道及肺部，逡逑引起结核感染［２８］。结核分枝杆菌从感染成功到最终发展为活动性肺结核，主要包逡逑括四个步骤：吞噬ＭＴＢ，邋ＭＴＢ的细胞内增殖，潜伏性感染期和活动性肺结核。逡逑这些步骤可以推进到不同的临床情景：自发治愈、疾病、潜伏感染的重新激活或逡逑重新感染［２９］。逡逑结核病在人群中流行的三个生物学环节为：传染源、传播途径和易感人群？，逡逑３１］。因此要控制结核病的流行应主要针对这三个环节。控制传染源，即结核病患逡逑者要做到及时诊断，规范治疗，各种医学技术的发展使得结核病不是不治之症，逡逑每年有数以万计的人成功治疗结核病；传播途径的切断，主要依靠的感染患者的逡逑自觉性，出门佩戴口罩不随地吐痰，少到人群密集的地方，以降低结核分枝杆菌逡逑的传播；最后保护易感人群

熔解曲线,多色,解曲线,分析技术

第一章绪论逡逑而逐渐提高。为了实现基因的定性检测，科学家在早期实时荧光ＰＣＲ的基础上，逡逑又逐渐推出多色探针熔解曲线分析技术，探针熔解曲线是发生在扩增结束后的一逡逑段连续升温的过程，对于基因突变有更好的区分效果，而且大大提高了检测通量。逡逑＿逦ＭＴ邋ＷＴ逡逑

原理图,检测体系,排布,探针

的补偿机制，且存在无义突变形式所以本体系暂不考虑和逡逑基因。以利福平基因的耐药决定区域８１ｂｐ为对象，建立单管四色利福平耐逡逑药突变的高灵敏检测体系，体系检测原理图如图２－２。逡逑Ｉ、＼、逡逑，邋、逡逑Ｚ逦Ｎ逡逑Ｚ逦、逡逑Ｚ逦、逡逑Ｚ逦、逡逑ｙ逦、逡逑ｚ逦、逡逑，ｚ邋ｈｅｘ逦ＢＨＱ２邋ＢＨＱ１邋ＦＡＭ邋Ｃｙ５邋ＢＨＱ２邋ＢＨＱ１逦ＲＯＸ邋、、逡逑ＲＦＰ－Ｐ－１邋＾＾ＲＦＰ－Ｐ－２ａ＾Ｕ＾ＲＦＰ－Ｐ－３ａ＾＾邋ＲＦＰ－Ｐ－４逦ｆｏｒｗａｒｄ邋ｐｒｉｍｅｒ逡逑逦邋Ｉ邋■■姦■邋■邋■邋Ｉ邋■邋Ｉ邋■邋■邋Ｉ邋Ｉ邋■邋■邋■邋ＩＩＩ邋■邋■邋Ｉ邋■■邋■邋■邋Ｉ逦＜邋逡逑ｚｚｚｔ逦邋８１逦ｂｐ耐药决定区逦逦逡逑———＞逡逑ｒｅｖｅｒｓｅ邋ｐｒｉｍｅｒ逦霰逡逑ＦＡＭ逦ＨＥＸ逦ＲＯＸ逦Ｃｙ５逡逑ＭＵＴ邋ＷＴ逦ＭＵＴ邋ＷＴ逦ＭＵＴ邋ＷＴ逦ＭＵＴ邋ＷＴ逡逑ｉＪｊｊＭｊＭｉＪＬ逡逑ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＣＣ）逦ＴｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆＣ）逦Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（Ｘ）逦Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（°Ｃ）逡逑图２－２：检测体系探针排布原理图。四个通道的探针均根据野生型设计，所以高。值逡逑熔解峰为野生型模版（ＷＴ），低值熔解峰为突变型模版（ＭＵＴ）。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２：邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｐｒｏｂｅ邋ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ邋ｓｃｈｅｍａｔｉｃ．Ｔｈｅ邋ｆｏｕｒ－ｃｈａｎｎｅｌ邋ｐｒｏｂｅｓ逡逑ａｒｅ邋ａｌｌ邋ｂａｓｅｄ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ邋ｄｅｓｉｇｎ

【参考文献】