miR-21通过A20调节内毒素休克的分子机制

发布时间：2020-07-11 14:08

【摘要】：背景与目的感染性休克的主要临床表现就是败血症。由于败血症呈现出高度变化的临床特征,使得精确的早期诊断变得比较困难,晚期诊断和延迟治疗会大大增加死亡率。生物标志物是潜在的有价值的临床工具,虽然已经有许多早期诊断败血症生物标记的研究,但是大部分没有被采纳或者在临床实验中被证明有效。为了在败血症中发现新的诊断和预后指标,基因组学的方法被应用到败血症研究当中,结果显示许多miRNA都可以作为炎症反应的关键调控因子。miRNA作为免疫应答的调节器,在败血症当中有着重要的转录调控作用。虽然越来越多的研究表明许多miRNA在败血症当中是高表达的,但是这些分子在败血症中的病理学机制并未研究透彻。有研究表明miR-21-3p在LPS诱导的败血症相关的心脏功能紊乱中是高表达的,通过antagomiR对miR-21-3p进行药理性抑制后能够提高小鼠的生存率,但是具体机制还不是很清楚。因此本实验中研究了miR-21在内毒素休克中的作用并对其调节机制进行了探讨。方法体内实验对miR-21 KO鼠和WT腹腔注射LPS诱导内毒素炎症性休克模型,监测48 h内小鼠的存活情况并记录绘制生存曲线。另外LPS注射6 h后ELISA检测小鼠外周血血清中IL-1β和IL-18含量,同时用PBS清洗小鼠腹腔并吸出,离心获得腹腔巨噬细胞并对腹腔巨噬细胞进行流式检测M1和M2巨噬细胞的比例。为了更加直观看到miR-21敲除后对内毒素休克的影响,对小鼠进行腹腔注射LPS 12 h后对小鼠肝脏、脾脏和肾脏进行HE染色观察炎症细胞的浸润情况。caspase-1的激活会导致IL-1β和IL-18的成熟和分泌,体外实验通过western检测小鼠BMDM在NLRP3炎症小体激活时caspase-1的活化情况,同时利用ELISA检测caspase-1激活时相应成熟IL-1β的分泌情况。对miR-21 KO和WT BMDM进行LPS预刺激4 h后采用ATP或尼日利亚杆菌刺激0 min,10 min,20 min,30 min,60 min后western检测caspas-1活化趋势,同时对应时间点的细胞上清用来检测caspase-1活化后IL-1β的分泌和LDH含量。在本实验中为了排除转染试剂和siRNA对AIM2炎症小体激活的影响,我们向BMDM中转染了dsDNA,通过western检测加入dsDNA后caspase-1的活化情况并利用ELISA检测细胞上清中IL-1β和LDH含量。有研究表明A20是NLRP3炎症小体的一个负向调节器,在随后的实验中我们通过western和qRT-PCR检测了miR-21 KO和WT BMDM中A20、NLRP3、caspase-1和ASC的表达情况,同时利用荧光素酶报告基因实验和qRT-PCR实验验证A20是miR-21的靶基因。随后通过向miR-21 KO BMDM中转染si-A20,western和qRT-PCR检测NLRP3、caspase-1和ASC的表达,通过ELSA检测细胞上清的IL-1β分泌。大量的研究结果表明NLRP3炎症小体相关的caspase-1与线粒体功能失调相关。在本研究中通过检测ROS确定线粒体受损情况。caspase-1的激活会切割GSDMD,产生一个GSDMD-N,它是促使细胞焦亡的直接片段。我们通过向BMDM细胞转染Flag-GSDMD慢病毒,使用anti-Flag western检测GSDMD的切割情况,同时采用直接使用anti-GSDMD检测GSDMD的切割情况。结果体内实验中生存曲线结果显示在miR-21敲除后小鼠的存活情况明显优于对照组,血清中的IL-β和IL-18含量及腹腔巨噬细胞比例少于对照组,肝脏、脾脏和肾脏组织HE染色显示miR-21 KO组的炎症细胞浸润明显少于对照组。体外实验结果表明NLRP3炎症小体在被LPS激活后能够导致caspase-1的活化,而caspase-1的激活会促进IL-1β的成熟和分泌。这一趋势会随着ATP或者尼日利亚杆菌激活NLRP3炎症小体的时间增长而加强。在miR-21 KO BMDM中,A20高表达,同时NLRP3、caspase-1和ASC在mRNA水平和蛋白水平低表达。A20是miR-21的一个靶基因,当在miR-21 KO BMDM中敲低A20后会恢复NLRP3、caspase-1和ASC的表达水平。在miR-21 KO BMDM中ROS的释放明显少于对照组。在caspase-1活化的同时发生了GSDMD-N诱导的细胞焦亡,但miR-21 KO组巨噬细胞的焦亡程度明显低于对照组。结论上述结果表明,miR-21敲除后在体内和体外都可以明显缓解LPS诱导的内毒素休克反应,降低炎症反应的程度。其机制是miR-21通过调节A20进而调节炎症小体影响细胞焦亡的发生,最终影响IL-1β分泌。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
【图文】：

4图 1 NLRP3 炎症小体激活信号通路图（四）miRNA 与败血症miRNA 是一种小的非编码 RNA，大约 22 个核苷酸的长度[27]。每种 miRNA都能调控几种靶基因的表达，并参与许多重要的过程，例如胚胎发育、免疫应答、炎症、肿瘤发生以及细胞生长和增殖[28]。也有研究表明在调节免疫系统功能方面具有重要作用[29]。在未激活的 T 细胞和抗原提呈细胞中的表达维持在较低水平，但是当这些细胞被激活以后的表达大幅升高[30-32]。新的研究表明有促炎作用，在许多自身免疫疾病如Ⅰ型糖尿病、多发性硬化症、类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮中具有重要作用。miRNA 的表达受许多胞内和胞外信号分子的调控。全反式视黄酸、PMA、GM-CSF、IL-4[33, 34]、LPS[35]都可以诱导单核细胞中的表达。因此，可以视为免疫细胞活化的一个重要标志物。成熟 miRNA 的种(Anand PK et.al.Frontiers in microbiology.2011)

图 2 作为脓毒症标志物的免疫 miRNAs 的作用机制（五）CRISPR-Cas9 技术本实验中的 miR-21 KO 鼠是通过 CRISPR-Cas9 的方法获得的。作为一种RNA 引导的基因组编辑工具，CRISPR-Cas9 第一次应用到哺乳动物的器官组织当中是在 2013 年，相比于其他传统的基因工具来说 CRISPR-Cas9 有许多优势，比如设计简单、方便使用和操作（能够同时编辑不同基因）。随后 CRISPR-Cas9成为了包括基因治疗研究在内的各种基因编辑的既方便又物有所值的工具。在细胞系或者动物模型中，CRISPR-Cas9 可以通过不同的方法实现不同的治疗目的。它可以纠正单基因突变从而缓解疾病，也可以编辑病原体的基因组比如 HIV实现治疗目的，或者在宿主组织诱导保护性和治疗性突变。此外在基因治疗癌症上它也具有很大潜能比如抑制致瘤基因活性或者诱导致癌基因抑制子的表达。对生殖细胞进行基因修饰是在动物模型当中研究基因治疗的一种传统手段。比如在杜氏肌肉营养不良症（一种遗传性 X 染色体相关的单基因疾病）的动物(Giza DE et.al.Cell Death and Differentiation.2016)

%酒精20 s——95%酒精30 s——无水乙醇1 min——二甲苯Ⅱ8。据处理和统计方法部数据输入 Excel 建立数据库，使用统计软件进行分析。组内比’s unpaired t-test，以 p<0.05 表示各差异有统计学意义。统计ad Prism Version 5.0来完成。流式数据采用FlowJo 7.6.1software进果iR-21 敲除后小鼠生存情况明显改善察 miR-21 KO 鼠在 LPS 诱导的败血症中的临床表现我们通过腹 WT 鼠和基因敲除鼠进行等剂量的 LPS 注射，在随后的 48 h 内生存情况进行检测，并绘制生存曲线。我们使用 7 周龄健康的 miR-21 KO 鼠。小鼠体重均在 18-20 g 范围内，注射的 LPS 浓结果表明在腹腔注射 LPS 8 h 后，两组小鼠的生存情况开始出现时 WT 组鼠全部死亡，而 miR-21 敲除鼠生存率明显高于 WT 组

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