基于高通量测序进行马来穿山甲疑似出血性肺炎致病菌筛查及耐药性基因的相关研究

发布时间：2020-07-16 06:08

【摘要】：已有很多文献指出保护性动物的抗菌耐药性(Antimicrobialresistance,AMR)和致病因子(Virulence factors)对于公共卫生安全的影响日益重要。现在临床上关于细菌耐药性的监测与关注还不够深入、全面,对于细菌耐药性研究还没有形成完整的理论基础。穿山甲是目前国际上野生动物保护极为关注的物种类群之一,因其独特的药用特性,长期受到盗猎和非法贩卖,甚至是跨境走私。然而目前在全世界范围内,对穿山甲的饲养还处于探索阶段,穿山甲经常患有各种疾病,对其治疗的效果也不明显。本文对广西壮族自治区陆生野生动物救护研究与疫源疫病监测中心收治的一些马来穿山甲疑似出血性肺炎病例进行测序、检测、分析,研究其携带的致病菌及耐药性,现将结果汇总如下:第一部分基于高通量测序进行马来穿山甲疑似出血性肺炎致病菌筛查目的为马来穿山甲出血性肺炎致病菌的筛查提供良好的基因组数据参考,明确导致穿山甲疑似出血性肺炎发病的病原微生物,为其疾病的防治研究奠定基础。方法本研究通过采集疑似出血性肺炎死亡马来穿山甲的肺部组织和非肺炎死亡的穿山甲肺部组织,全部组织分别提取DNA,并将疑似肺炎死亡的马来穿山甲肺部组织进行全基因组测序分析。对测序结果进行分析筛选,利用PCR在疑似肺炎和非肺炎死亡马来穿山甲的肺部组织中进行实验验证。结果我们在16例宏基因组测序的疑似肺炎死亡马来穿山甲肺部组织样本中,发现了37种细菌的存在,其中出现频率较高的是假单胞菌属(Pseudomonas),葡萄球菌属(Staphylococcus),芽孢杆菌属(Bacillus),链球菌(Streptococcus),梭状杆菌属(Clostridium),支原体属(Mycoplasma),螺原体属(Spiroplasma),脲原体属(Ureaplasma),棒状杆菌属(Corynebacterium),乳酸菌属(Lactobacillus),乳球菌属(Lactococcus),肠球菌属(Enterococcus),变形杆菌属(Proteus),摩氏摩根菌属(Morganella)等。对样本中出现频率较高且与肺炎相关的6种细菌的PCR验证结果表明,在疑似出血性肺炎和非肺炎死亡的马来穿山甲肺部组织中都检测到了假单胞菌属和芽孢杆菌属,而葡萄球菌属、链球菌属、梭状杆菌属、摩氏摩根菌属只存在于疑似出血性肺炎死亡的马来穿山甲肺部组织中。结论通过对全基因组测序分析及PCR验证,在马来穿山甲疑似出血性肺炎样本中发现了多种细菌,我们推断马来穿山甲死亡的病因存在多种致病菌的协同作用。为了进一步明确该批马来穿山甲患病的病因,我们仍需对其进行更加深入的研究与探索。第二部分马来穿山甲疑似出血性肺炎相关优势菌株的筛选及耐药性分析目的进一步验证以上的研究结果,实施针对性的检测,取得更详实的实验数据,支持临床上的工作。方法通过重新收集救护期间疑似出血性肺炎死亡的的马来穿山甲个体,采集病死马来穿山甲的肺部样本进行细菌的培养纯化分离、细菌16s r DNA通用引物PCR测定等,将所得细菌PCR阳性产物进行基因组测序。细菌PCR测序结果与NCBI数据库的数据进行比对以确定细菌种类。另外,对以上培养纯化分离的两种细菌的菌液通过DNA小片段文库测序(PE150),拼接组装后进行耐药基因的分析,探讨病原菌的耐药性。结果对采集新死亡的5只疑似出血性肺炎死亡马来穿山甲的肺部组织进行细菌培养分离,均得到葡萄球菌属,主要为金黄色葡萄球菌。结合临床治疗效果,我们选择两株优势菌(溶血性葡萄球菌和金黄色葡萄球菌)进行全基因组测序。对耐药基因分析发现,这两种菌株携带有很多类型的抗生素耐药基因(包括万古霉素、替考拉宁、杆菌肽、枯草杆菌抗生素、钠类抗菌药物、大环内酯物、林肯(酰)胺、链菌素b等)。同时,临床治疗也发现,对携带有这些抗生素耐药基因的个体使用相应的抗生素治疗效果不理想。结论根据细菌培养及鉴定结果,葡萄球菌属在疑似出血性肺炎死亡的马来穿山甲肺部组织属于优势菌群,尤其是金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌溶血性葡萄球菌携带很多类型的抗生素耐药基因,这些结果为马来穿山甲的疾病防治提供重要的基础资料。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R563.1;R446.5
【图文】：

高通量,测序,穿山甲,马来

图 1-1 高通量测序筛选出的 37 个细菌的频率与丰度图Fig. 1-1 The frequency and abundance for 37 bacteria from metagenome sequencing3.3 PCR 在穿山甲疑似出血性肺炎组及对照组中验证为了验证疑似出血性肺炎死亡与非肺炎死亡马来穿山甲肺部组织中的致病菌与高通量测序筛查菌群分布是否有差别，结合文献报道，我们筛选了以上在 37 种菌属在样本中出现频率较高且与出血性肺炎相关的 6 种菌群（葡萄球菌属，芽孢杆菌属，梭状杆菌属，链球菌属、假单胞菌和摩氏摩根菌）进行 PCR 验证。验证样本包含以上测序的 16 例疑似出血性肺炎死亡马来穿山甲肺部组织和 15 例非肺炎死亡马来穿山甲的肺部组织。首先，提取马来穿山甲肺部组织 DNA 且将其 PCR 产物进行了电泳，葡萄球菌属的目的基因片段长度为 484 bp，芽孢杆菌属的目的基因片段长

菌群,病例,检出率,检测情况

图 1-2 6 种菌群在病例组及对照组中的检出率Fig. 1-2 Detection rate of 6 species of bacteria in pathological group and control group图 1-3 6 种菌群在样本中的 PCR 检测注：图 A1-3 为病例组中的检测情况，图 A4-6 为对照组中的检测情况，图 B 为不同细菌在病例组中的检测情况，图 C 为摩氏摩根菌在病例组中的检测情况Fig. 1-3 Detection of PCR in six species of bacteria in samplesNote: Figure A1-3 is the detection in the case group, Fig. A4-6 is the detection in the control group, Figur Bis the detection of the different bacteria in the case group, Figure C is the detection of the Morganella moriiin the case group.4 讨论

检测情况,病例,菌群,常见菌

出率与高通量测序基本一致。这些检测结果表明芽孢杆菌和假单胞菌是穿山甲肺部常见菌属，而另外 4 种菌属可能与出血性肺炎相关。图 1-2 6 种菌群在病例组及对照组中的检出率Fig. 1-2 Detection rate of 6 species of bacteria in pathological group and control group

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