区分HIV-1近期与长期感染间接ELISA法的建立与评价

发布时间：2020-07-19 06:44

【摘要】：研究背景人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)是引起获得性免疫缺陷综合征(Acquired immunodeficiency syndrome,AIDS,又称为艾滋病)的病原体,HIV感染的潜伏期一般8-10年。传统免疫学方法检测抗HIV抗体,只能判断是否感染HIV,不能区分HIV新发感染,难以准确监测HIV流行趋势及评价干预措施的效果。基于横断面样本估算HIV新发感染率的实验室检测方法在近年来有一定的研究进展,但尚未有公认的金标准。本课题组前期研究发现HIV-1跨膜糖蛋白gp41中57氨基酸多肽(gp41-p57)能够区分HIV-1近期和长期感染,但具体的抗原决定簇氨基酸序列,以及HIV不同基因型氨基酸的差异对检测结果的影响,尚需进一步研究确定。研究目的研究gp41-p57多肽抗原在区分HIV-1近期和长期感染中起主要作用的抗原决定簇及其基因型特异性,初步建立基于我国流行的HIV-1基因亚型gp41抗原区分HIV近期和长期感染实验室检测方法,为HIV新发感染率的监测、预防或治疗措施的效果评价提供研究方法和工具。研究方法1.基于HIV gp41-p57序列,通过人工合成10条长短不一的系列短肽为检测抗原,以间接ELISA法研究其与HIV-1近期和长期感染样本的免疫反应特征,分析gp41多肽的抗原决定簇。2.合成源自我国流行的CRF01_AE、B、CRF07_BC和CRF08_BC四种亚型的gp41-p57多肽,以间接ELISA法研究其与HIV-1不同基因亚型感染样本的免疫反应特征,分析gp41-p57基因型特异性。3.构建原核表达载体,通过免疫印迹实验和间接ELISA法分析所纯化目的蛋白的免疫活性,获得包含HIV-1 CRF01_AE、B、CRF07_BC和CRF08_BC亚型gp41_p57的融合蛋白MP4。4.以融合蛋白MP4为检测抗原,建立区分HIV-1近期和长期感染的间接ELISA法,通过与商品化试剂盒LAg-Avidity EIA检测结果比较,评价所建立方法的灵敏度、特异度以及阳性预测值和阴性预测值。研究结果1.确定了HIV gp41-p57多肽中QKFLG和GKIIC序列是区分HIV-1近期感染和长期感染中起主要作用的抗原决定簇。p57多肽两端序列EAQQHLLQLT和WNSSWSN可能影响抗原抗体的识别或结合。基于p57多肽建立的方法与商业化试剂盒检测结果的一致率为0.923,约登指数为0.923,受试者工作曲线下面积为0.987。说明HIV-1 gp41-p57多肽可作为区分HIV-1近期感染和长期感染方法的检测抗原。2.HIV不同基因型的gp41_p57多肽序列存在差异,影响检测结果的灵敏度。将来自HIV-1优势基因型的gP41-p57多肽混合后作为检测抗原,可以提高检测方法灵敏度。3.与商业化试剂盒比较,基于融合蛋白MP4的检测方法对37份纵向样本和159份横断面样本的检测结果的一致率分别为0.890和0.730,灵敏度分别为90.91%和96.85%,特异度分别为100.00%和71.88%,近期感染预测值分别为88.24%和85.19%,长期感染预测值分别100.00%和85.19%。基于融合蛋白MP4的检测方法对159份样本重复检测三次,仅7份样本(4.40%)结果不完全一致,检测方法的可靠性为95.60%。研究结论本研究确定了区分HIV-1近期和长期感染的gp41多肽抗原决定簇及其基因型特异性。基于我国HIV主要基因亚型gp41抗原的融合蛋白MP4,初步建立了区分HIV-1近期感染和长期感染的间接ELISA法。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R512.91;R446.6
【图文】：

逦第一章前言逦逡逑进行干预，有利于改善预后和减少ＨＩＶ的传播，为ＨＩＶ新发感染率的监测及预防逡逑或治疗措施的效果评价提供方法和工具。逡逑本研究基本技术路线如下图：逡逑１＋１０

构而影响抗原抗体的结合，对近期感染阶段的影响或更大。逡逑将基于多肽Ｐ５７和ｐｌ－ｐ７间接ＥＬＩＳＡ法检测５３份ＨＩＶ－１近期与长期感染样逡逑本的结果绘制ＲＯＣ曲线（图３－２），各检测方法的截断值见表３－２，其曲线下面逡逑积均大于０．８，提示各检测方法具有较高的诊断价值。逡逑表３－１样本的基本信息逡逑Ｔａｂｌｅ邋３－１邋Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ邋ｏｆ邋ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ邋ａｎｄ邋ｓａｍｐｌｅｓ邋ｕｓｅｄ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｓｔｕｄｙ逡逑ＨＩＶ－１感染分期逡逑组别逦基因分型样本量近期感染，长期感染，邋ｐ逡逑逦样本量（％）样本量（％）逦逡逑纵向样本逦ＮＴ＊逦３７逦１５（４０．５）逦２２（５９．５）邋ＮＴ逡逑感染天数逦４０－６０２逦４０－１２０逦１２８－６０２逦ＮＴ逡逑平均感染天数逦２４１±１７８逦７４±２７逦３５５±１４１逦＜０．０５ｂ逡逑横断面样本逡逑门诊病人逦ＮＴ逦１６逦８邋（５０．０）逦８邋（５０．０）邋ＮＴ逡逑ＭＳＭ邋人群和邋ＩＤＵ邋人群邋ＣＲＦ０１＿ＡＥ逦５６逦１４（２５．０）逦４２（７５．０）逦０．１０７ｃ逡逑ＣＲＦ０７＿ＢＣ逦４９逦１１（２２．４）逦３８（７７．６）逡逑ＣＲＦ０８＿ＢＣ逦２９逦１（３．４）逦２８（９６．６）逡逑Ｓｕｂｔｙｐｅ邋Ｂ逦１２逦２（１６．７）逦１０（８３．３）逡逑Ｏｔｈｅｒｓ逦１５逦５（３３．３）逦１０（６６．７）逡逑逦Ｔｏｔａｌ逦１６１逦３３（２０．５）逦１２８（７９．５）逦逡逑ａＮＴ，未检测或未计算。逡逑ｂｐ，Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｏｅｙ检验。逡逑ＣＰ邋

逡逑图３－１邋ＨＩＶ－１邋ｇｐ４１抗原决定簇分析逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３－１邋Ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ邋ｅｐｉｔｏｐｅｓ邋ｏｆ邋ＨＩＶ－１邋ｇｐ４１逡逑（Ａ）各多肽与ＨＩＶ－ｌ近期感染（Ｒ，空心圆形）和长期感染样本（Ｌ，实心方形）反应强度的逡逑比较。各组样本的平均０Ｄ值用短横线表示，各多肽上方数值为长期感染样本平均０Ｄ值与逡逑近期感染样本平均０Ｄ值的比值。（Ｂ）邋３０份长期感染样本对各氨基酸残基的反应性。逡逑３０逡逑

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本文编号：2762070