单一手性甲基苯丙胺致大鼠亚急性中毒后的代谢、金属组学研究

发布时间：2020-07-23 10:44

【摘要】：联合国《2018年世界毒品问题报告》显示,全球至少吸毒一次的人数保持稳定,约为2.75亿人,占全球15-64岁人口的5.6%,其中大麻、类阿片及苯丙胺类滥用最为严重,约有45万人因吸毒死亡且呈上升趋势。甲基苯丙胺(methamphetamine,METH)属于滥用最严重的苯丙胺(amphetamine,AM)类兴奋剂之一,其化学结构中有一个不对称手性中心,存在2个对映异构体,分别为S-(+)-METH和R-(-)-METH,其对中枢神经系统的作用、毒性及代谢机制均有较大差异。其中R-(-)(左旋)一般影响交感神经系统,多用于医疗方面;而S-(+)型(右旋)具有强烈的中枢神经系统刺激作用,毒性很强,具有成瘾性,为管制药物,是“冰毒”的主要成分。因此,对METH的绝对构型进行区分并分别研究其对机体靶器官的损伤和毒性机制显得尤为重要。研究表明,METH亚急性中毒可诱发多种损伤,如肝损伤、脑神经损伤及心血管损伤等,且METH滥用者、成瘾性实验动物的脑和骨代谢物均发生了显著变化。另有研究发现,METH滥用者毛发中的微量元素含量相较正常人出现明显的紊乱。随着组学技术的兴起与发展,多种与疾病、损伤及中毒机制相关的生物标志物得以发现,而METH致机体亚急性中毒后代谢物整体轮廓变化及相关标志物发现依然鲜有研究,而将差异性代谢物、元素与靶器官损伤相结合的机制研究尚未见报道。基于此,本论文采用液相色谱串联质谱联用法(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)首先建立并优化了毛发中METH和AM手性对映异构体的定性定量分析方法。结果表明,线性关系良好,各构型相关系数均0.99,日间/日内精密度均12%。利用该法对50余例METH滥用者的毛发进行检测,其中有35例(70%)同时检出单一的S-(+)-METH和S-(+)-AM,剩余 15例中有9例(18%)同时检出了S-(+)-METH、S-(+)-AM、R-(-)-METH和R-(-)-AM,但均以S构型为主。该法高效便捷,为后续单一手性的甲基苯丙胺毒性损伤研究提供分析方法支撑。其次,选取单一手性的S-(+)-METH开展Sprague Dawley(SD)大鼠亚急性中毒模型研究,将24只成年雄性SD大鼠随机分成两组,METH组通过4天(一天2次)内连续腹腔注射(Intraperitonealinjection,i.p.)15mg/mL/kg METH造成亚急性中毒;对照(Control)组注射相同量的生理盐水。与Control组相比,METH组大鼠血清中谷丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(Aspartate aminotransferase,AST)含量显著增加,提示存在明显的肝损伤,病理学组织切片观察进一步证实了这一现象。为了进一步研究相关代谢物、微量元素与肝损伤的相关性,并寻找可能的生物标志物,本研究共选取了在动物血浆中稳定存在且具有变异性18种小分子代谢物和19种元素进行整体轮廓定量分析并进行了方法学验证,采用SIMCA-P软件中的偏最小二乘判别分析(Partial Least Squares Discrimination Analysis,PLS-DA)模型绘制得分图(score plot)并归类,Control组和METH组均可实现完全分离,基于变量重要性投影(variable importance in projection,VIP,VIP1)和t检验方法(p0.05),最终确定5种差异性代谢物(脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸、生物素和烟酰胺)和6种差异性元素(硼、钴、硒、镍、钾和砷)。基于上述发现,结合KEGG数据库和Metaboanalyst 4.0程序中相关代谢物通路的分析表明,METH致大鼠亚急性中毒后可能阻断了脯氨酸和丝氨酸生物合成的两种途径以及烟酰胺代谢。以上研究,为手性甲基苯丙胺的实际司法鉴定工作提供了科学依据与技术支持,进一步的肝损伤与代谢、金属组学相关性研究为METH导致的亚急性中毒机制提供了科学解释,相关差异性代谢物和元素的发现为可能的METH中毒诊断提供了理论基础。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R749.64
【图文】：

色谱图,二级质谱,手性色谱柱,质谱

２．３．２色谱条件的优化逡逑实验初始使用ＤＡＩＣＥＬ邋ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ？邋ＩＡ－３手性色谱柱，但发现该色谱柱对逡逑苯丙胺类对映异构体选择性较差（见图２－２），无法实现分离。最终，本实验采逡逑用ＳＵＰＥＬＣＯ邋Ａｓｔｅｃ邋ＣＨＩＲＯＢＩＯＴＩＣ？邋Ｖ２手性色谱柱，该色谱柱的填料含有万古逡逑霉素，对胺类化合物立体选择性较好。逡逑２逡逑１逡逑产￣？逦Ｉ逦■逦广一邋＾逦Ｉ逦■逡逑１邋（ｍｉｎ）逡逑图２－２采用ＤＡＩＣＥＬ邋ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ？邋ＩＡ－３手性色谱柱的总离子流色谱图逡逑色谱峰：１．邋ＡＭ邋（ｍ／ｚ邋１３６．１／９１．２）；邋２＿邋ＭＥＴＨ邋（ｍ／ｚ邋１５０．１／９１．１）．逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｔｏｔａｌ邋ｉｏｎ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＤＡＩＣＥＬ邋ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ？邋ＩＡ－３邋ｃｈｉｒａｌ邋ｃｏｌｕｍｎ逡逑Ｐｅａｋ邋ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：邋１．邋ＡＭ邋｛ｍ／ｚ邋１３６．１／９１．２）；邋２．邋ＭＥＴＨ邋｛ｍ／ｚ邋１５０．１／９１．１）．逡逑２２逡逑

色谱图,手性色谱柱,总离子流,色谱图

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氨水,甲醇,目标化合物,冰醋酸

逑基于此，本实验考察采用不同有机相和水相时目标化合物的分离效果（见逡逑图２－３）。使用乙腈作为有机相、含０．２％邋（Ｖ／Ｖ）冰醋酸的０．０５％邋（Ｖ／Ｖ）氨水逡逑作为水相时，ＭＥＴＨ和ＡＭ手性对映异构体始终无法分离（显示为单峰），而逡逑将有机相更换为甲醇时，ＭＥＴＨ与ＡＭ手性对映异构体可实现初步分离，且甲逡逑醇对目标化合物具有更好的分离选择性，因此将甲醇确定为有机相。开始使用逡逑一元流动相，向甲醇内添加不同的酸、碱溶液，并尝试改变甲醇内添加剂的类逡逑型和比例，但均未能获得较好分离。然后改用二元流动相进行分离，并比较了逡逑含０．２％邋（Ｖ／Ｖ）冰醋酸的０．０５％邋（Ｖ／Ｖ）氨水与含０．１％邋（Ｖ／Ｖ）甲酸的２０ｍｍｏｌ／Ｌ逡逑乙酸铵水溶液作为水相时的分离效果，发现使用后者时ＭＥＴＨ与ＡＭ的手性对逡逑映异构体分离效果较为稳定（分离度分别为１．５２和１．６１），峰形较好，响应高，逡逑而在前一种流动相下

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