雾化吸入溶血磷脂酸对脓毒症大鼠肺损伤修复及肺内源性MSCs数量的影响

发布时间：2020-07-24 15:32

【摘要】：目标:本课题通过LPS脓毒症大鼠急性肺损伤(acute lung injury ALI)模型,研究体内炎症因子TLR4信号转导通路与间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的变化,了解ALI的发病相关机制。探讨雾化吸入溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid,LPA)对LPS引发的大鼠急性肺损伤是通过增高MSCs数量并抑制TLR4信号转导通路的炎症反应而促进肺损伤的修复。方法:60只SD大鼠随机分为5组:大鼠尾静脉分别注射PBS和LPS设为正常组(NC组)、脓毒症急性肺损伤组(LPS组),LPS组中一部分肺损伤大鼠静脉注射LPA拮抗剂Ki 16425(LPS+KI组),其中一部分LPS组及LPS+KI组大鼠分别雾化设为肺损伤大鼠雾化LPA治疗组(LPS+LPA组)、LPA治疗组(LPS+LPA+KI组)。在雾化LPA第一天(d1)及第七天(d7)分别麻醉大鼠,解剖后收集肺组织选用病理HE染色、湿/干重测定;收集外周血,ELISA检测大鼠外周血血清中TLR4、NFk B、IL-6及IL-21浓度;RT-PCR检测TLR4 m RNA及LPA受体m RNA的表达;western bolt检测NFk B/p-NFk B、ERK/p-ERK蛋白的表达,流式细胞术检测MSCs表面标志的相关抗体,计算各组MSCs百分比,研究LPA对MSCs数量的影响。结果:HE染色结果显示,LPS组d1镜下可见肺泡和肺间质炎细胞浸润及出血,间隔增厚,d7镜下可见肺泡和肺间质炎细胞浸润及出血,间隔增厚,肺泡上皮部分坏死及透明膜形成。LPS+LPA组镜下可见少数肺泡及肺间质炎细胞浸润和轻度出血,间隔轻度增厚,大部分透明膜修复,同时,LPS组较正常组大鼠肺组织湿/干重比增高(p0.01),LPS+LPA组较LPS组肺组织湿/干重比降低(p0.01),证明各组造模成功;ELISA实验显示,LPS组大鼠较正常组TLR4、NFk B、IL-6、IL-21的表达均增高(p0.001),LPS+LPA组较LPS组TLR4、NFk B、IL-6、IL-21的表达均降低(p0.01),LPS+LPA+KI组较LPS+LPA组TLR4、NFk B、IL-6、IL-21的表达均增高(p0.01);RT-PCR实验显示,LPS组大鼠肺组织较正常组TLR4 m RNA的表达明显增高(p0.01),LPS+LPA组较LPS组TLR4 m RNA的表达均降低(p0.001),LPS+LPA+KI组较LPS+LPA组TLR4 m RNA的表达均增高(p0.01),且作为LPA受体LPAR1/2,实验发现LPS+LPA组分别较NC组、LPS组中LAPR1/2m RNA的表达增高(p0.01,p0.001),LPS+LPA+KI组较LPS+LPA组TLR4 m RNA的表达降低(p0.01)。western bolt检测LPS组大鼠肺组织p-NFk B的蛋白表达明显增高(p0.01),LPS+LPA组较LPS组p-NFk B的蛋白表达降低(p0.01),LPS+LPA+KI组较LPS+LPA组p-NFk B的蛋白表达增高(p0.05),而LPS组p-ERK的蛋白表达降低(p0.01),LPS+LPA组较LPS组p-ERK的蛋白表达增高(p0.01),LPS+LPA+KI组较LPS+LPA组p-ERK的蛋白表达降低(p0.01),并具有显著性。且流式细胞术检测MSCs表面标志的相关抗体,得LPS+LPA组较LPS组、正常组MSCs%增高(p0.01),LPS+LPA+KI组较LPS+LPA组MSCs%降低(p0.05),并具有显著性。结论:1、ALI模型病理镜下可见肺内炎细胞浸润及出血,间隔增厚,同时肺组织湿/干重比较正常组明显增高,证明ALI大鼠造模成功,且LPS引发ALI大鼠血清中炎症因子(TLR4、NFk B、IL-6、IL-21)的表达增高,肺组织TLR4 m RNA及p-NFk B的蛋白表达增高,表明ALI中LPS通过TLR4途径参与炎症反应。2、雾化LPA能降低LPS引发ALI大鼠血清中炎症因子(TLR4、NFk B、IL-6、IL-21)的表达、肺组织TLR4 m RNA及p-NFk B的蛋白表达,同时提高了肺内p-ERK蛋白表达和增加MSCs数量,病理可见肺内炎细胞浸润、出血减轻,透明膜修复,表明LPA通过抑制TLR4信号通路激活及增加MSCs数量对脓毒症肺损伤进行修复,为脓毒症肺损伤改善预后提供了思路。3、LPA抑制剂KI模型病理肺内炎细胞浸润、出血加重,且大鼠血清中炎症因子(TLR4、NFk B、IL-6、IL-21)的表达较LPS组增高,肺组织TLR4 m RNA及p-NFk B的蛋白表达较LPS组增高,同时使p-ERK蛋白表达和MSCs LPS组数量较LPS组下降。反向说明LPA通过抑制TLR4信号通路激活及增加MSCs数量对脓毒症肺损伤进行修复。
【学位授予单位】：内蒙古医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R459.7
【图文】：

间隔极重度增厚，肺泡透明膜形成，d7 较 d1 损伤减轻，肺损伤评分其中两片图 1 分，两张 3 分，其余图均为 2 分；LPS+LPA 组，d1 镜下可见肺泡轻度充血隔轻度增厚，少量白细胞浸润，肺泡上皮部分坏死及肺泡腔消失及透明膜大部分较 LPS 组 d1 的病变减轻，肺损伤评分其中一张切片图 0 分，三张 2 分，其余图分。d7 镜下可见轻度肺泡及肺间质炎细胞浸润和轻度出血，肺泡间隔轻度增厚，分透明膜修复，较 LPS 组 d7 明显减轻，肺损伤评分其中两张切片图 0 分，其余图1 分；LPS+LPA+KI 组，d1 镜下可见中度肺泡及肺间质炎细胞浸润和中度出血，肺隔中度增厚，小部分透明膜修复，较 LPS+LPA 组 d1 病变改善程度差，肺损伤评中一张切片图 0 分，两张 2 分，其余图均为 1 分。d7 镜下可见肺泡轻度充血，肺间质少量白细胞浸润，间隔轻度增厚，肺泡上皮坏死部位及透明膜小部分修复LPS+LPA 组 d7 病变改善程度差，肺损伤评分其中一张切片图 0 分，两张 2 分，其均为 1 分。；LPS+KI 组与 LPS 组损伤程度相近，损伤评分相近(见图 1)。

图 1.2 d7 各组大鼠肺组织病理切片图(均为 HEX400)注：A.正常组；B. LPS 组；C. LPS+LPA 组；D. LPS+LPA+KI；E. LPS+KI评估肺损伤的严重程度，进行 0-4 分半定量分析需依据以下五项：①肺泡及肺间炎细胞浸润②肺水肿③肺泡及肺间质出血④间隔增厚肺不张⑤透明膜形成，损伤评分果(见表 3)表 3 脓毒症肺损伤大鼠模型肺损伤的严重程度评分表NC 组 LPS 组 LPS+LPA 组 LPS+LPA+KI 组 LPS+KI 组d1 0.5±0.49 3±0.90 1±0.71 1±0.74 3±0.79d7 0.5±0.48 2±0.13 0±0.69 1±0.74 2±0.90

修复 LPS 所致组织炎症及肺损伤。LPS+KI 组较 LPS 组无统计学差异(t=1.561,p>0.05表明抑制剂 KI 自身无修复损伤能力，无明显进一步加重损伤趋势。d7LPS 组与 d1LPS 组增高(t=8.95,p<0.01),d7 LPS+LPA 组与 d1LPS+LPA 组增高(t=5.79 ,p<0.01 ),d7LPS+LPA+KI组与d1LPS+LPA+KI组增高(t=8.2,p<0.01),表明d7较d炎症损伤减轻。(见表 4，图 2)表 4 脓毒症大鼠肺修复损伤模型 d1、d7 肺组织湿/干重(W/D)比值NC 组 LPS 组 LPS+LPA 组 LPS+LPA+KI 组 LPS+KI 组d1 4.24±0.27 5.61±0.16***4.46±0.18**##4.97±0.23￥￥5.63±0.16d7 4.33±0.21 5.51±0.21***&&&4.55±0.15***###&&&4.89±0.12￥￥￥&&5.75±033&&&注：***p<0.001、**p<0.01、*p<0.05，*与正常组比，#与 LPS 组比，&与 LPS+LPA 组比，$与 d1 对比

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本文编号：2769038