碳量子点介导纳米基因传递与U251干细胞诱导分化研究

发布时间：2020-07-31 20:52

【摘要】：脑胶质瘤(GBM)在所有肿瘤疾病中,是最为强侵袭性、难治疗的肿瘤之一,而胶质瘤干细胞(GSC)是导致GBM发展以及后续复发的基本因素,因此针对肿瘤干细胞的治疗是彻底根治肿瘤的过程。近年来,随着再生医学、组织工程、基因治疗等技术的快速发展,采用基因工程的方法作为一种抑制胶质瘤的治疗手段,其作用越来越突出。其中,病毒载体方法是应用最广的基因传递方法,但仍然存在一定的局限性。人们把目光更多地转向了非病毒载体系统和联合基因治疗。利用物美价廉的原料制备高效的非病毒纳米载体是基因治疗研究的热点之一。本课题着重制备了新型非病毒纳米载体——碳量子点(Carbon quantum dots,CDs),并以此为载体进行U251干细胞的神经分化研究,以及相关的诱导分化以及体内验证和机理研究,为GBM的基础研究以及临床治疗提供新方法、新思路。第一章综述基于GBM的世界性难题、干细胞学说的提出、基因疗法的优势以及在基因载体的多样化基础,本章内容分两大部分即GBM的研究进展和CDs的研究进展,分别进行总结与概述。介绍了GBM的疾病现状、研究方向以及治疗手段,包括各自方法的优缺点以及在理论研究、临床研究、临床中的治疗应用现状;着重介绍CDs作为新型纳米基因载体,主要包括其发展、制备方法、在基因传递中的广泛应用以及展望,对本课题的提出奠定坚实的理论基础。第二章CDs的制备与表征本章制备并优化CDs的处方工艺,具体包括:以壳聚糖季铵盐和无水乙二胺(EDA)为原材料,在预实验基础上通过一系列实验设计,制备16种CDs样品;在此基础上,考察了两种除菌方法即过滤除菌和加热除菌,以荧光强度、DNA凝胶电泳、CDs携带EGFP质粒能力为指标,考察各个处方得到最佳量子点样品为第七组样品:即后反应温度为160℃,EDA用PBS稀释5倍,所占体系总体积比为20%,除菌法为过滤除菌法;基因与CDs的最佳基因转染比为1:10,以后将此样品作为后续转染、诱导的基础,进行一系列相应研究。进一步对最佳量子点样品进行TEM、粒径电位、IR、细胞毒性等表征。经实验结果得知,CDs对细胞的毒性较小,几乎无毒,具明亮绿色荧光,可作为非病毒载体应用于组织工程研究。第三章CDs介导的U251干细胞体外诱导分化研究本章主要从以下三个方面进行开展,首先对U251细胞进行干细胞诱导培养基(ES培养基)培养,通过流式细胞仪筛选CD133~+的U251细胞,得到U251干细胞作为后续实验的种子细胞。经八种入胞抑制剂的入胞机制筛选,说明CDs纳米基因传递系统通过网格蛋白、穴陷小泡介导的细胞内吞作用实现入胞。其次,以Wnt3a、Brn2、Ascl-1三种转录因子自由组合,进行最佳因子组合筛选,从免疫荧光(immunofluorescence,IF)结果得出,Wnt3a、Brn2因子组合在最短时间内可实现U251干细胞向神经细胞分化,因此将其组合作为最佳基因组合做进一步研究。后续U251干细胞经CDs载最佳基因组合进行转染诱导,经四次转染后,细胞首先从形态上呈现类似于神经细胞的结构形态,之后由IF、酶联免疫分析(ELISA)、反转录-PCR(QT-qPCR)和蛋白印迹(Western blotting,WB)实验从定性定量角度证明,干性标记物蛋白CD133表达呈现明显下调的迹象;GFAP作为胶质细胞的特性随转染诱导的时间延长表达下调,神经细胞相关蛋白(NeuN,β-Tubulin III(Tuj1))随转染时间的延长呈现逐渐上调,探讨了神经分化效能;另外也考察了基因转录水平和蛋白水平,实验结果表明CDs成功将基因Wnt3a和Brn2转入细胞内进行生物转录与翻译,并且有向神经细胞分化的可行性,在GBM的基础理论研究方面提供了又一新思路。第四章CDs介导的U251干细胞体内诱导分化研究本章主要研究U251干细胞以及诱导后的U251干细胞在裸鼠体内原位移植后的分化情况。从裸鼠生存状态、体重变化、成瘤性、组织切片HE染色、免疫组化等方面评价体内神经诱导效能,并通过基因芯片对分化机理进行初步研究。结果表明实验组裸鼠生存状态相对良好,体重相对稳定,HE和免疫组化染色表明,实验组异型性相对对照组不是很明显,肿瘤细胞转而呈向神经细胞分化的趋势。通过对基因芯片数据分析得知,p53等癌基因相关通路的相关蛋白呈下调趋势。研究结果与体外研究数据相一致,可为胶质疾病提供可靠的临床前研究数据与依据。第五章Wnt、Notch通路研究本章通过Wnt通路和Notch通路相关因子的表达情况,研究转录因子与两个通路之间的关系。首先进行QT-qPCR检测,考察Notch信号通路关键基因Notch1和HES-1的表达强弱,发现通路蛋白的降低与U251干细胞的分化密切相关。其次,采用免疫组化法检测Wnt通路中相关蛋白的表达水平可知,U251干细胞经CDs的载神经转录因子的诱导分化实现向神经细胞分化,同样证明在U251干细胞的诱导分化方面,Wnt通路具有重要作用。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R450;R739.4
【图文】：

荧光颜色,对照组,温度,样品

图 2.1 不同组 CDs 荧光颜色图(A、B、C、D 分别代表后反应温度为 160 °C、170 °C、180 °C、190 °C，1、2、3、4、5 分别代表后反应时间为 2 h、3 h、4 h、5 h、对照组：UP水)FIG. 2.1 fluorescence color of CDs in different groups（A, B, C, D respectively representafter reaction temperature of 160 °C, 170 °C, 180 °C, 190 °C, 1, 2, 3, 4, 5 respectivelyrepresent after the reaction time of 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, control ：UPwater）如图 2.1，经手提式紫外分析仪于 365 nm 波长下照射可见，16 种 CDs 样品呈现不同程度的绿色荧光。其中，D3 因为碳化无荧光，D4 略有碳化现象；剩余的 D 组和 C 组样品呈现的绿色荧光强于 A、B 组的，B 组 4 种样品荧光无明显差异，A 组中 A2、A4 强于 A3、A5，但是在视野下依旧是很强烈的绿色荧光。而对照组双蒸水溶液呈现无色透明，经多次验证，制备的 CDs 样品较成功，颜色均一且深。

局部放大图,蛋白表达,样品,转染

图 2.3 CDs 样品转染 EGFP 基因的蛋白表达图（图片为最佳 CDs 样品的 EGFP 蛋白表达图，其余样品均无表达，B 为 A 的局部放大图）Figure 2.3 protein expression of CDs-transfected EGFPPlasmid The protein expressionpicture of EGFPgene transfected by CDs samples (these figures are the EGFPproteinexpression of the best CDs sample, while other samples are not expressed.B is partialenlarged view ofA)在得到的上述各样品的最低基因滞留比的基础上进行优化，考察最佳基因转染比，以此得到最佳转染的 CDs 样品。即先进行样品最低滞留比的上下二倍关系的滞留比设置（如对于可得 160°C 反应 2h 的最低滞留比为 1：15，因此可设置最佳基因转染比为 1：7.5，1：15，1：30，其他比例以此类比）。之后进行 CDs载基因转染，48h 后观察到有且只有一组比例样品有蛋白表达，即有 EGFP 的绿色荧光，其余均无荧光出现，由此得到最佳 CDs 样品和最佳基因转染比。其中，

电位测定

图 2.4 CDs 的电位测定图Figure 2.4 Zeta potential chart of CDs对最佳 CDs 样品进行电位测定，测得 CDs 的电位呈现电正性，数值为㧏17.88mV，质粒因带负电荷与 CDs 结合后，电位值有所下降，但整体依旧带正电荷为㧏7.98mV。因此带正电荷的 CDs 与带负电荷的基因在静置时由于静电吸附作用可自组装成纳米粒，为 CDs 载基因进人细胞提供条件。2.3.5 粒径考察

【参考文献】