去泛素化酶USP14调控脓毒症炎症反应及其分子机制研究

发布时间：2020-08-09 02:53

【摘要】：[研究背景和目的]脓毒症(sepsis)是急危重症领域常见的临床综合征,涉及全身性炎症反应,临床治疗困难,死亡率居高不下。目前对脓毒症的发病机制、病理生理过程仍缺乏清晰的认识,且经过诸多的努力和探索,仍未找到针对脓毒症的特异性药物或疗法,鉴于人们对脓毒症发病过程的困惑及其给临床治疗造成的巨大压力,深入探索脓毒症的发病机制和治疗的新方向有着非一般的迫切性和重要的现实意义。泛素-蛋白酶体系统(Ubiquitin-proteasome System,UPS)介导了真核细胞大部分蛋白质的降解,具有调节炎症、细胞增生、信号转导、转录调控和细胞凋亡等多种生物学功能,是目前研究免疫细胞炎症反应机制的新热点。去泛素化酶USP14是细胞内UPS的重要调节酶,参与泛素介导蛋白酶体降解蛋白质的过程,在肿瘤、神经系统疾病和衰老的研究中较为广泛,但在炎症反应中的作用报告很少。本研究将阐述去泛素化酶USP14在脓毒症炎症反应中的作用和分子机制,为脓毒症的治疗提供新的潜在性靶点。[研究方法]1.通过脂多糖(LPS)诱导人类急性单核白血病细胞THP-1和鼠来源的巨噬细胞RAW264.7,构建脓毒症体外细胞炎症模型。2.给予不同浓度的LPS(0、100、250、500ng/ml)作用THP-1细胞12、24h,Western blot检测LPS对细胞内USP14的蛋白表达影响。3.采用不同方法阻断细胞内USP14的去泛素化作用(IU1抑制USP14的活性、siRNA干扰USP14的转录表达),进而研究USP14在脓毒症炎症反应中的作用和分子机制。4.建立THP-1炎症细胞模型,采用USP14的特异性抑制剂IU1预处理THP-1细胞2h:MTS检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA检测细胞培养上清中促炎因子(TNF-α、IL-6)的释放量,qRT-PCR检测细胞促炎因子(TNF-α、IL-6)mRNA的表达水平,Western blot检测MAPK、NF-κB通路相关蛋白的表达以及NF-κB P65核转位变化,细胞免疫荧光共聚焦进一步观察NF-κB P65核转位情况。5.建立THP-1炎症细胞模型,采用脂质体(Lipofectamine 3000)转染USP14 siRNA48h对THP-1细胞进行预处理:MTS检测细胞活力,ELISA检测细胞培养上清促炎因子(TNF-α、IL-6)的释放量,Western blot检测MAPK、NF-κB通路相关蛋白的表达以及NF-κB P65核转位变化。6.建立RAW264.7炎症细胞模型,采用USP14的特异性抑制剂IU1预处理RAW264.7细胞2h:MTS检测细胞活力,ELISA法检测细胞培养上清中促炎因子(TNF-α、IL-6)的释放量,qRT-PCR检测细胞促炎因子(TNF-α、IL-6)mRNA的表达水平,Western blot检测MAPK、NF-κB通路相关蛋白的表达以及NF-κB P65核转位变化。[研究结果]1.LPS刺激THP-1细胞和RAW264.7细胞后,ELISA结果表明,LPS组与对照组相比,细胞培养上清分泌的TNF-α和IL-6显著升高,可成功构建脓毒症体外细胞炎症模型。2.不同浓度(0、100、250、500ng/ml)LPS 作用 THP-1 细胞 12、24h,与对照组相比,LPS并不影响细胞内USP14的蛋白表达。3.IU1在100μ 范围内对细胞活力无明显影响,LPS联合IU1处理细胞,与LPS组相比,细胞调亡情况无明显差异。4.siRNA(40nM)转染细胞48h对细胞活力无明显差异,Western blot检测USP14的蛋白表达明显下调,获得较好的敲低效率。5.IU1抑制USP14的活性,在THP-1及RAW264.7细胞炎症模型中,qRT-PCR检测促炎因子(TNF-α、IL-6)mRNA的表达水平明显下降,与ELISA检测所反映的抗炎效果一致,另外Western blot的结果显示ERK1/2的磷酸化减少,但JNK、P38的磷酸化水平未见明显改变,同时,IκBα的磷酸化降解减少,使IκBα的表达增加,抑制了 NF-κB p65的核转位。6.siRNA干扰USP14的转录表达,在THP-1细胞炎症模型中,能有效减少促炎细胞因子(TNF-α、IL-6)的释放量,同时减少了 ERK1/2和IκB的磷酸化,增加IκBα的表达,抑制NF-κB p65的核转位。[结论]去泛素化酶USP14通过增加ERK1/2的磷酸化和NF-κB的活化调节LPS诱导的炎症反应。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R459.7
【图文】：

双染后行流式细胞术评估细胞凋亡情况。ＬＰＳ和不同浓度的ＩＵ１邋（２５，邋５０，邋７５逡逑和１００邋ＭＭ）共处理ＴＨＰ－１细胞，并没有增加ＬＰＳ诱导ＴＨＰ－１细胞Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ逡逑和ＰＩ的染色，即ＩＵ１抑制ＵＳＰ１４的活性后不影响ＴＨＰ－１细胞凋亡（

反应影响的分子机制，我们研究了邋ＵＳＰ１４是否可以调节ＭＡＰＫ活化。首先，逡逑我们发现，用不同浓度的ＬＰＳ作用ＴＨＰ－１细胞，ＵＳＰ１４的蛋白表达水平没有改逡逑变（图３Ａ）。而正如我们所假设的，抑制ＵＳＰ１４的活性显著降低了邋ＬＰＳ诱导逡逑的ＥＲＫ１／２的磷酸化，但对ＴＨＰ－１细胞中ＪＮＫ１／２和ｐ３８邋ＭＡＰＫ的磷酸化没有逡逑影响（图３Ｂ）。同时，我们发现通过ＵＳＰ１４ｓｉＲＮＡ沉默ＵＳＰ１４，邋ＵＳＰ１４的蛋逡逑白表达明显下调，即明显敲低了邋ＵＳＰ１４Ｃ图３Ｃ，邋Ｄ），而敲低ＵＳＰ１４同样显著逡逑降低ＴＨＰ－１细胞中ＬＰＳ诱导的ＥＲＫ１／２磷酸化（图３Ｅ）。上述结果表明：在逡逑ＴＨＰ－１细胞中，抑制ＵＳＰ１４的活性或者敲低ＵＳＰ１４阻断其去泛素作用，可以逡逑减少ＬＰＳ诱导的ＥＲＫ１／２的磷酸化。逡逑Ａ逡逑１２ｈｏｕｒ逦２４ｈｏｕｒ逡逑０逦１００邋２５０邋５００邋０逦１００邋２５０邋５００邋ＬＰＳ（ｎｇ／ｍＬ）逡逑？参S茫織

本文编号：2786496