高正电荷绿色荧光蛋白在糖胺聚糖及蛋白聚糖检测中的应用

发布时间：2020-08-19 09:46

【摘要】：蛋白聚糖(Proteoglycan,PG)是生物体内的一类复杂的生物大分子,由一个核心蛋白和共价偶联的一条或者几条糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)侧链构成。GAGs又名粘多糖,是一种聚阴离子直链杂多糖,由重复的二糖单位连接而成。根据单糖残基种类、残基间糖苷键的类型以及糖链上硫酸基的数目和位置不同,可以分为透明质酸(Hyaluronic acid,HA)、硫酸软骨素(Chondroitin sulfate,CS)/硫酸皮肤素(Dermatan sulfate,DS)、硫酸角质素(Keratan sulfate,KS)和肝素(Heparin,Hep)/硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)四大类,其中HA是唯一一种不能与核心蛋白结合形成PGs的GAGs。PGs广泛存在于细胞表面和细胞外基质中,它们可以和生长因子、细胞因子等生物分子相互作用,调节细胞增殖、迁移、分化和细胞间的信号转导等生理病理过程,在医学药学等领域具有广范的研究和应用价值。基于PGs核心蛋白种类的多样性,及GAGs侧链的种类和数目多样性使得PGs结构和种类复杂多样,其中GAGs侧链的复杂性为PGs功能的多样化提供了关键的结构基础。在GAGs侧链合成过程中多种酶对其进行了特异性修饰,使得糖链结构高度复杂多样,这种结构的复杂性赋予了它们功能上的多样性,但也给其检测带来了巨大的困难。目前常用的GAGs/PGs检测方法有基于碱性染料的GAGs化学染色法、基于核心蛋白特异性抗体和GAGs侧链的专一性降解酶的生化检测,以及利用高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)、质谱(Mass spectrometry,MS)和核磁共振波谱法(Nuclear magnetic resonance,NMR)的仪器分析法等。但是这些检测方法还存在着很多不足,如生物相容性差,不适合活体染色;检测灵敏度低,选择性差;实验操作复杂,检测时间长;实验所需仪器和维护费用昂贵等。因此,目前急需开发一种简便、高效、灵敏且生物相容性好的GAGs/PGs检测方法。高正电荷绿色荧光蛋白(Supercharged green fluorescent protein,ScGFP)是一种通过基因工程改造手段获得的带有36个正电荷的绿色荧光蛋白,它的细胞毒性低,生物相容性好,荧光稳定性高,且细胞穿透能力强,在生物大分子分析检测和跨膜运输中具有重要的应用价值。本论文以ScGFP为生物探针,结合GAGs特异性降解酶和针对于PGs核心蛋白的特异性抗体,针对GAGs和PGs检测中急需解决的问题,在分子、细胞和器官水平上首次将ScGFP运用于GAGs/PGs的分析检测,并在对相关分析条件进行了全面优化的基础上,将其应用于复杂生物样本和临床样品的检测。检测结果证明了 ScGFP作为一种新型的生物相容性荧光探针,在GAGs/PGs的分析检测中具有重要的应用价值。本论文的主要研究成果如下所述:1.以石墨烯和ScGFP为探针的GAGs均相检测方法的建立与应用:在均相检测体系中利用氧化石墨烯(Graphene oxide,GO)作为荧光淬灭剂,通过能量共振转移可以对ScGFP进行荧光淬灭,但是这种淬灭作用在溶液中存在GAGs时会被抑制。GAGs与ScGFP通过电荷相互作用而结合,进而阻碍GO的淬灭作用,与没有加入GAGs的阴性对照相比出现荧光恢复现象,且具有剂量依赖关系,因此可以根据溶液中荧光恢复的强度来对均相检测体系中GAGs进行定量分析。均相检测方法建立后,首先对各个反应条件进行了优化,通过优化最终获得了最佳反应缓冲液为l10mM Tris-HCl,100 mM NaCl,pH 7.4;最佳反应顺序为先混合ScGFP与GAG再加入GO;ScGFP和GO的最佳反应终浓度分别为2.5μg/ml和50 μg/ml,以及最佳反应时间为室温避光反应30 min。在最佳反应条件下对缓冲溶液中不同种类、不同浓度的GAGs进行检测。不同种类的GAGs与ScGFP的结合能力不同,因而介导的荧光恢复能力也不同。Hep与ScGFP的结合能力最强,结合常数为9.35E7/摩尔,介导荧光恢复的能力最强,检测得到的荧光读数最高;CSA和DS与ScGFP的结合能力次之,结合常数值分别为4.53E7/摩尔,4.54E7,检测得到的荧光读数次之;HA与ScGFP的结合能力最弱,检测到的荧光读数太弱以致不能计算出相应的结合常数。在不同浓度GAGs的检测中还发现随着检测体系中GAGs浓度的升高,检测到的荧光数值逐渐增强,两者之间存在着很好的线性关系。通过制备标准曲线,可以对溶液中的GAGs含量进行快速检测。在此基础上进一步将该方法应用于血清中Hep的检测,检测结果表明这种均相检测方法对于复杂生物样品中GAGs的检测依然有效,是一种简单可靠的血清Hep检测方法,这在临床中监测血液中Hep的给药浓度,减少因Hep过量使用引起的出血等并发症具有重要的意义。最后利用该均相检测方法对Hep中其它GAGs杂质和过硫酸化硫酸软骨素(Oversulfated chondroitin sulfate,OSCS)污染物进行了检测,结果表明该检测方法对于Hep中其它GAGs杂质的检测不灵敏,但可以最低检测到10-6(w/w)%的OSCS。因此对于Hep中痕量OSCS污染物的检测具有着较高的特异性和灵敏度,为Hep药品质量的监测提供了一种有效方法。该新型均相检测方法与传统方法相比,具有简单、快速和灵敏的特点,在GAGs样品的分析检测和质量控制中具有重要的应用价值。2.ScGFP对活细胞表面和小鼠器官中GAGs的可视化检测:根据ScGFP生物相容性好,细胞毒性低,稳定性强等优点,将其作为荧光探针对活细胞表面以及小鼠活体内脏器官中GAGs的种类和含量进行了可视化检测。结果表明不同种类细胞表面的GAGs种类和含量各不相同,其中A549细胞表面的CS/DS含量高于Hep/HS含量,而HEK 293T细胞表面的Hep/HS含量则高于CS/DS含量,这些结果与各细胞的GAGs提取分析结果相一致。此外将ScGFP通过尾静脉注射入小鼠体内,观察小鼠器官中GAGs的分布。通过可视化检测发现ScGFP可以较长时间的结合在小鼠各器官中,在小鼠体内的降解代谢较为缓慢,8小时时检测到的荧光强度依旧很高。通过不同种类GAGs特异性降解酶的辅助检测发现用GAGs降解酶处理过的小鼠内脏器官荧光强度显著减弱,且硫酸软骨素ABC酶处理后的小鼠器官荧光强度比肝素酶降解处理后的荧光强度弱,这表明小鼠各器官中ScGFP的停留是由于它与GAGs相互作用的结果,且小鼠各器官的CS/DS表达含量多于Hep/HS表达含量。通过ScGFP荧光探针的使用,我们可以简便高效的对活细胞及器官中的GAGs进行可视化检测,检测结果清晰可见。这表明ScGFP是一种有效的GAGs可视化检测探针,首次为众多生理病理过程中GAGs可视化与检测提供了稳定可靠的高生物相容性荧光探针,具有着重要的意义。3.PGs均相检测方法的建立和在HCC体外诊断中的应用:通过抗原制备,小鼠免疫,细胞融合,杂交瘤筛选,抗体纯化等过程获得了两种针对于蛋白聚糖Glypican-3(GPC3)核心蛋白不同抗原表位的高亲和力单克隆抗体。利用抗原抗体的特异性结合以及电荷间的相互作用建立了一种简便、灵敏、高效的GPC3均相检测方法。其检测原理为:偶联于羧基石墨烯表面的两种不同的单克隆抗体可以识别GPC3核心蛋白的不同抗原表位,在反应体系中通过共同结合GPC3而形成夹心结构;GPC3又可以通过HS侧链结合ScGFP,使其位于夹心结构的中间,同时拉近其与石墨烯的距离,导致更大程度的荧光淬灭,最终通过荧光淬灭程度来检测体系中GPC3的含量。该均相检测方法建立后首先对其各反应条件进行优化,通过优化得到试剂的最佳添加顺序为先加入结合有一种抗体的石墨烯与GPC3,再加入ScGFP,最后加入结合有另一种抗体的石墨烯,这种添加顺序可以使ScGFP位于夹心结构中间,其荧光可以得到最大程度的淬灭,以此来提高检测的灵敏度。除此之外,其它的优化条件分别为:选用羧基石墨烯作为荧光淬灭试剂,并在羧基石墨烯上偶联终浓度为0.01 mg/ml的单克隆抗体,随后石墨烯上其他部位用1%的BSA进行封闭;在110mM Tris-HCl,100 mM NaCl,pH 10.0缓冲体系中加入抗体1-石墨烯和GPC3室温避光放置5 min,随后加入终浓度为0.375 μg/ml的ScGFP,室温避光放置15 min,最后加入抗体2-石墨烯室温避光孵育110min,并检测荧光强度。利用这种新型均相检测方法对缓冲溶液和血清中的GPC3进行定量分析,结果表明ScGFP的荧光淬灭程度随着检测体系中GPC3含量的增加而增强,ScGFP的荧光淬灭程度与GPC3含量的log2数值存在着较好的线性关系,因此可以通过制备标准曲线,对未知浓度的GPC3样品进行定量检测。最后,将该方法成功应用于临床HCC血清样本GPC3的检测,结果表明HCC组的GPC3含量平均值显著高于正常组和良性肝病病人组的平均值,HCC组的GPC3平均含量是正常组含量的12倍,是良性肝病病人组的8倍。以良性肝病病人组GPC3含量的平均值加两倍的标准差数值3.71 ng/ml来作为HCC的检测下限值,其检测灵敏度为59.5%,高于其它检测方法56%(53-59%)的灵敏度。该新型均相方法与传统的夹心ELISA法相比,操作简单,无需反复的孵育洗杂过程,检测灵敏度高,特异性好,同时检测迅速,检测反应在1小时内可以完成,在HCC的早期诊断中具有着重要的应用价值。此外这种均相检测方法也为各种其它PGs的分析检测建立了通用的技术平台。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.3;R446.1
【图文】：

糖胺聚糖,化学结构,糖结构,结构功能

１．２糖胺聚糖（ＧＡＧｓ）的结构功能及检测逡逑１．２．１邋ＧＡＧｓ的结构和分类逡逑ＧＡＧｓ主要分为四大类：ＨＡ、ＣＳ／ＤＳ、ＫＳ和Ｈｅｐ／ＨＳ，其二糖结构如图１－逡逑１所示。逡逑Ｌ逦Ｊｎ邋Ｌ逦ＯＨ邋ＨＯ’邋ＮＨＡｃ邋ｎ逡逑Ｄ－ＧｌｃＵＡ逦Ｄ￣＜；ｌｃＮＡｃ逦Ｄ＿Ｇａｉ逦Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ逡逑ＨＡ逦ＫＳ逡逑Ｄ－Ｃ１ＣＵＡ逦Ｄ＾１ＮＡＣ逦Ｌ－ｌｄｏｌＡ逦ＤＣａｌ．ＮＡｃ逡逑ｃｓ逦ＤＳ逡逑Ｄ－ＣｌｃｌＡ邋Ｉ＞－Ｇ１ｃＮ０３Ｈ／Ｄ－Ｇ１ｃＳＡｃ逦Ｌ－ＩｄｏＵＡ邋Ｄ－ＧｌｃＮＳＯ，Ｈ／Ｄ－ＧｌｃＮＡｃ逡逑ＨＳ逦Ｈｅｐ逡逑Ｒ：Ｈ／Ｓ０３－，邋Ｒ，邋：Ｓ０，－／Ａｃ逡逑图１－１糖胺聚糖的化学结构逡逑１４逡逑

原理图,检测方法,均相,探针

在本章节中我们将以ＳｃＧＦＰ为生物探针，探究一种简便、高效、灵敏的ＧＡＧｓ均逡逑相检测方法。逡逑新型均相检测方法的检测原理如图２－１所示。图（ａ）中的氧化石墨烯逡逑（Ｇｒａｐｈｅｎｅ邋ｏｘｉｄｅ，ＧＯ邋）是一种焚光洋灭试剂，可以通过能量共振转移逡逑（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｒｅｓｏｎａｎｃｅｅｎｅｒｇｙｔｒａｎｓｆｅｒ，ＦＲＥＴ）作用将焚光蛋白的焚光进行淬灭逡逑（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．２０１１，邋Ｃｈａｎｇｅｔａｌ．２０１０，Ｗａｎｇｅｔａｌ．２０１０）。但当溶液中存在邋ＧＡＧｓ逡逑时（如图ｂ所示），由于电荷相互作用，ＳｃＧＦＰ可以与ＧＡＧｓ结合。ＧＡＧｓ的存逡逑在就会抑制ＧＯ对ＳｃＧＦＰ的淬灭作用，与没有加入ＧＡＧｓ的阴性对照相比出现逡逑荧光恢复现象，并且这种抑制作用与样本中ＧＡＧｓ的浓度呈现出较好剂量依赖逡逑关系。所以根据这一检测原理，我们以ＳｃＧＦ

重组蛋白,荧光淬灭,荧光强度,淬灭

２．３．２邋ＧＯ对ＳｃＧＦＰ的荧光淬灭作用逡逑为检测ＧＯ对ＳｃＧＦＰ的荧光淬灭作用，在５明／ｍｌ的ＳｃＧＦＰ溶液中加入不逡逑同终浓度的ＧＯ，检测荧光强度。从实验结果（图２－３）可以看出，加入ＧＯ后逡逑ＳｃＧＦＰ的荧光强度显著降低，并且随着ＧＯ浓度的增加ＳｃＧＦＰ的荧光强度逐渐逡逑降低。当加入１０邋Ｈ丨的ｌｍｇ／ｍｌ邋ＧＯ时，检测荧光值微弱，荧光强度可以淬灭高逡逑达９５．２％，因此可以选用终浓度为５０吨／ｍｌ的ＧＯ进行后续实验。ＧＯ对于ＳｃＧＦＰ逡逑的荧光淬灭作用主要是由于它们之间的能量共振转移造成的，ＧＯ的这种高淬灭逡逑能力可以有效的降低检测背景值，提高检测的灵敏度，将更加有利于ＧＡＧｓ的分逡逑３６逡逑

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