基于CAIX的靶向纳米泡在恶性肿瘤超声分子显像中的实验研究

发布时间：2020-08-21 09:43

【摘要】：背景恶性肿瘤是临床高发疾病,其发生率和死亡人数不断增加,严重威胁着人类生命健康,早期发现对肿瘤的治疗效果影响深远。影像技术的大力发展使影像学检查方法在恶性肿瘤诊断中发挥着其他实验室检查方法不可替代的作用,其能无创诊断体内肿瘤的位置和大小。超声检查是目前临床诊断恶性肿瘤常用的影像学方法之一,其具有实时动态显像、安全无放射性、操作方便简单等优点。但常规超声检查仅能发现恶性肿瘤的解剖结构和血流动力学的改变,尚不能早期发现恶性肿瘤中分子表达水平的变化,故不能真正实现恶性肿瘤的早期诊断。超声造影技术是超声领域的第三次革命,静脉注射超声造影剂后,能显著增强肿瘤病灶与周围正常组织的超声显像对比度,从而提高恶性肿瘤诊断的准确性。但目前临床上使用的超声造影剂仅能在肿瘤组织的血管内增强超声显像,尚不能进入肿瘤组织血管外间隙中增强超声显像。由于肿瘤组织中存在渗透和滞留增强(enhanced permeability and retention,EPR)效应,故纳米级超声造影剂能穿过肿瘤血管聚集在肿瘤组织间隙中,从而能实现肿瘤的血管外超声显像。纳米泡是一种新型的纳米级超声造影剂,在其表面连接针对肿瘤组织血管外靶分子的特异性配体,能进一步提高纳米泡在肿瘤血管外组织间隙中的聚集和结合能力,靶向增强肿瘤的超声显像,活体内有效监测肿瘤组织血管外间隙中分子表达水平的变化,从而提高恶性肿瘤早期诊断和预后评估的准确性。碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX,CAIX)在多种肿瘤(如肺癌、肾癌、宫颈癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌、头颈部肿瘤等)细胞膜上高度表达,是恶性肿瘤发生发展过程中的重要蛋白分子。相关研究发现构建针对CAIX的分子探针能实现恶性肿瘤的分子显像,且抑制CAIX活性能实现恶性肿瘤的靶向治疗。我们前期研究分别将抗CAIX的单克隆抗体和纳米抗体连接到纳米泡表面,构建出针对肾癌的靶向纳米泡,并证实与空白纳米泡相比,其体外能与肾癌786-O细胞特异性结合,且在体内裸鼠移植瘤模型上具有更强的增强超声显像强度。但是相关研究仅局限于肾癌的超声分子显像,且仅研究其在移植瘤组织中的增强超声显像效果,尚未深入研究靶向纳米泡在多种肿瘤组织中超声分子显像的规律及形态学基础。多肽是由α-氨基酸以肽键的方式连接构成的氨基酸序列,其分子量小、化学结构简单、分布广泛、免疫原性低,已在分子诊断和药物治疗中得到广泛的应用。多肽PGLR-P1是针对CAIX蛋白多糖区的特异性配体,故将PGLR-P1连接到脂质纳米泡上构建出的靶向纳米泡能使来源于多种器官的恶性肿瘤靶向增强超声显像,实时监测肿瘤组织中CAIX的表达水平,从而有利于多种恶性肿瘤早期诊断准确性的提高。相关研究表明多肽介导的靶向超声造影剂反复注射后易引起机体免疫反应,故其临床应用受限。而适体是一种与生物大分子或细胞特异性结合的RNA或单链DNA序列,其具有结构多样、作用范围广、易于修饰、无免疫原性等优势,已在分子识别、实验诊断和疾病治疗中发挥重要的作用。因此,构建出粒径小、安全性高、特异性强,且适体介导的靶向超声造影剂,并研究其在体内超声分子显像的效果和形态学基础将是我们进一步深入探索的内容。基于上述研究现状,我们从两个部分分别进行基于CAIX的靶向纳米泡在恶性肿瘤中实现超声分子显像的实验研究,首先构建携载CAIX多肽的靶向纳米泡,并在体内外实验中研究其结合CAIX表达阳性肿瘤细胞的能力及增强CAIX表达阳性移植瘤超声显像的效果与规律;其次针对携载CAIX多肽的靶向纳米泡的不足,将CAIX适体偶联在纳米泡表面构建出适体介导的靶向纳米泡,探讨其在移植瘤组织中靶向增强超声显像的能力及形态学基础。目的1.研究携载CAIX多肽的靶向纳米泡体外特异性结合CAIX表达阳性肿瘤细胞和体内增强CAIX表达阳性移植瘤超声显像的能力,探索其在不同类型移植瘤组织中分布差异的原因,为多种恶性肿瘤超声分子显像提供一种小型化、增强超声显像效果好的新型靶向超声造影剂,也为靶向造影剂实现来源于不同器官的肿瘤实质细胞超声分子显像提供研究方法。2.针对携载CAIX多肽的靶向纳米泡的不足,研究偶联CAIX适体的靶向脂质纳米泡与肿瘤细胞特异性结合能力和靶向增强超声显像的效果,深入探讨靶向纳米泡在体内增强超声显像的形态学基础,不仅为恶性肿瘤超声分子显像提供安全性高、特异性强的超声分子探针,同时也为靶向纳米泡诊断恶性肿瘤奠定详实的研究基础。方法1.携载CAIX多肽的靶向纳米泡增强恶性肿瘤超声显像的研究(1)化学固相合成法合成CAIX多肽PGLR-P1,机械震荡法制备脂质纳米泡,通过生物素-亲和素法将CAIX多肽连接到脂质纳米泡表面制备靶向纳米泡,荧光标记证实靶向纳米泡表面携载CAIX多肽,并评价靶向纳米泡的粒径、电位、形态、分布、细胞毒性及稳定性。(2)光学显微镜和流式细胞术检测靶向和空白纳米泡体外结合肿瘤细胞的能力,并在琼脂糖模型中分析两种纳米泡体外增强超声显像效果、增强超声显像衰减速度以及高机械指数的超声波对靶向纳米泡增强超声显像强度的影响。(3)构建裸鼠肾癌786-O、宫颈癌HeLa和胰腺癌BxPC-3细胞移植瘤模型,比较靶向和空白纳米泡在移植瘤组织中的增强超声显像效果(达峰时间、峰值强度、持续时间及曲线下面积),并对比分析两种纳米泡在肝肾组织中的增强超声显像效果。(4)组织免疫荧光技术观察靶向纳米泡在移植瘤组织和肌肉组织中的分布情况,免疫组织化学染色检测移植瘤组织的CAIX表达情况,并分析靶向纳米泡在不同移植瘤组织中分布差异的原因。2.CAIX适体介导的靶向纳米泡在恶性肿瘤超声分子显像中的研究(1)体外指数富集配体系统进化技术筛选出针对CAIX蛋白的单链DNA适体,高通量测序分析CAIX适体的序列,细胞免疫荧光技术和流式细胞术验证细胞水平CAIX适体与肿瘤细胞结合的特异性。(2)在脂质纳米泡的基础上,应用硫醇-马来酰亚胺法制备偶联CAIX适体的靶向纳米泡,荧光标记验证其偶联CAIX适体的能力,并评价其基本表征及细胞毒性,体外模型中比较靶向和非靶向纳米泡增强超声显像的能力。(3)激光共聚焦显微镜下细胞水平观察靶向和非靶向纳米泡与肿瘤细胞的结合情况,在荷瘤裸鼠中比较靶向和非靶向纳米泡增强移植瘤超声显像的能力(达峰时间、峰值强度和曲线下面积),小动物活体荧光成像进一步评估靶向纳米泡在移植瘤组织中的聚集能力。(4)冰冻切片上研究靶向纳米泡在移植瘤组织血管内外的分布情况、偶联CAIX适体的能力及结合肿瘤细胞的能力,HE染色观察移植瘤的组织学特点,蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)检测移植瘤组织CAIX蛋白的表达情况,并阐明靶向纳米泡在恶性肿瘤中实现超声分子显像的形态学基础。结果1.携载CAIX多肽的靶向纳米泡增强恶性肿瘤超声显像的研究(1)成功合成了CAIX多肽PGLR-P1,制备的靶向纳米泡表面均匀携载CAIX多肽,其粒径为503.7±78.5 nm,且具有分布均匀、形态规则、稳定性高和细胞毒性低的优点。(2)靶向纳米泡体外与786-O和HeLa细胞发生特异性结合,而不结合BxPC-3细胞,且空白纳米泡与三种肿瘤细胞均不结合。两种纳米泡的体外超声造影显像效果和衰减速度无显著差异(P0.05),且高机械指数超声辐照后,靶向纳米泡的超声造影显像强度显著降低(P0.05)。(3)靶向和空白纳米泡在裸鼠肝肾组织中超声造影显像的达峰时间、峰值强度和持续时间均无显著差异(P0.05)。在786-O和HeLa移植瘤组织中,靶向纳米泡的增强超声显像效果和空白纳米泡有显著差异,其具有更高的峰值强度、更长的持续时间和更大的曲线下面积(P0.05);而两种纳米泡的增强超声显像效果在BxPC-3移植瘤组织中无显著差异(P0.05)。(4)静脉注射靶向纳米泡后,其能分布于移植瘤组织血管内外,且在786-O和HeLa移植瘤组织中的数量显著多于其在BxPC-3移植瘤组织中,而在肌肉组织中仅能分布于血管内。免疫组织化学染色发现786-O和HeLa移植瘤组织表达CAIX,而BxPC-3移植瘤组织不表达CAIX,故移植瘤组织中CAIX表达的差异导致了靶向纳米泡的分布差异。2.CAIX适体介导的靶向纳米泡在恶性肿瘤超声分子显像中的研究(1)筛选出针对CAIX蛋白的特异性单链DNA适体,细胞免疫荧光技术和流式细胞术均证实CAIX适体对786-O和HeLa细胞具有良好的特异性结合能力,但与BxPC-3细胞无结合能力,且等长度的无义适体均不结合三种肿瘤细胞。(2)CAIX适体均匀分布于靶向纳米泡表面,且靶向纳米泡粒径小、分布均匀、大小相近、安全性高。体外靶向纳米泡和偶联无义适体的非靶向纳米泡的增强超声显像效果无显著差异(P0.05)。(3)体外靶向纳米泡特异性聚集在786-O和HeLa细胞周围,而未聚集在BxPC-3细胞周围,且非靶向纳米泡均未聚集在三种肿瘤细胞周围。与非靶向纳米泡相比,靶向纳米泡在786-O和HeLa移植瘤组织中的增强超声显像具有更高的峰值强度和更大的曲线下面积(P0.05),而两者在BxPC-3移植瘤组织中的增强超声显像效果无显著差异(P0.05)。小动物活体荧光成像显示靶向纳米泡特异性聚集在786-O和HeLa移植瘤组织中。(4)激光共聚焦显微镜发现分布在移植瘤组织血管外间隙中的靶向纳米泡仍能稳定偶联CAIX适体,且在786-O和HeLa移植瘤组织中的靶向纳米泡数量显著多于非靶向纳米泡,而靶向和非靶向纳米泡在BxPC-3移植瘤组织中的数量无显著差异。WB显示CAIX在786-O和HeLa移植瘤组织中高表达,而在BxPC-3移植瘤组织中不表达,故在CAIX适体的介导下,靶向纳米泡能特异性增强移植瘤的超声显像。结论1.携载CAIX多肽的靶向纳米泡在体外能与CAIX表达阳性的肿瘤细胞特异性结合,在体内能靶向增强CAIX表达阳性移植瘤的超声显像,为来源于不同器官的肿瘤实质细胞超声分子显像提供了一种全新的靶向超声造影剂。2.偶联CAIX适体的靶向纳米泡具有体外特异性聚集在多种肿瘤细胞周围的能力,并在肿瘤实质细胞超声分子显像中具有良好的显像效果,为适体介导的靶向超声造影剂增强肿瘤的超声显像提供了实验方法和研究基础。3.静脉注射后,靶向纳米泡能通过肿瘤的EPR效应扩散至移植瘤组织间隙中,在其表面的特异性配体作用下,靶向结合表达特定靶分子的肿瘤细胞,显著增强肿瘤的超声显像,从而实现肿瘤实质细胞的超声分子显像。
【学位授予单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R445.1;R730.44
【图文】：

透射电镜,质谱分析,多肽,靶向

图 2-1 CAIX 多肽的质谱分析。（A）生物素化多肽的质谱图，（B）FITC 标记的生物素化多肽的质谱图。2.3.2 靶向纳米泡的表征检测靶向和空白纳米泡的浓度分别是(10.70±0.82)x108/ml 和(11.53±0.81)x108/ml，两者的浓度无显著差异（P>0.05）。Zetasizer Nano ZS90 检测仪结果显示靶向和空白纳米泡的粒径分别为 503.7±78.5 nm 和 428.1±41.8 nm（图 2-2 A 和 B）。空白纳米泡的电位为-19.27±2.21 mV，其原因是制备空白纳米泡的脂质成分中含有阴离子磷脂 DPPA[101]。靶向纳米泡的电位为-14.80±2.12 mV，表明 CAIX 多肽т氨基基团的正电荷能部分中和阴离子磷脂的负电荷，也间接证实靶向纳米泡т携载 CAIX 多肽[102]。靶向纳米泡的负电位有利于其通过静电排斥维持稳定性。光学显微镜н，靶向纳米泡分布均匀、粒径大小相近，无明显的聚集和破灭现象，稳定性好（图 2-2 C）。透射电镜н，靶向纳米泡呈规则黑色圆形，边界清楚，粒径在 500nm 左右，其у Zetasizer Nano ZS90 检测仪的测量结果相致（图 2-2 D）。使用肾癌 786-O 细胞进行 MTT 试验，评估靶向和

物理表征,纳米,细胞毒性,靶向

纳米泡的物理表征及细胞毒性。（A）靶向纳米泡的粒径分布图，（B）空白（C）光学显微镜н观察靶向纳米泡的分布，（D）透射电镜н观察靶向纳泡的细胞毒性评价，*表示统计学分析两者之间有显著差异（P<0.05）。光共聚焦显微镜н，DiI 标记的靶向纳米泡脂质膜显示为红色荧光（使靶向纳米泡表面携载的 CAIX 多肽显示为绿色荧光（图 2-3 B）重叠（图 2-3 C），直接证实靶向纳米泡表面携载 CAIX 多肽。п白纳米泡和携载无荧光标记的 CAIX 多肽的靶向纳米泡均未显示

靶向,纳米

图 2-2 纳米泡的物理表征及细胞毒性。（A）靶向纳米泡的粒径分布图，（B）空白纳米泡的粒径分布图，（C）光学显微镜н观察靶向纳米泡的分布，（D）透射电镜н观察靶向纳米泡的形态，（E）纳米泡的细胞毒性评价，*表示统计学分析两者之间有显著差异（P<0.05）。在激光共聚焦显微镜н，DiI 标记的靶向纳米泡脂质膜显示为红色荧光（图 2-3 A），FITC 标记使靶向纳米泡表面携载的 CAIX 多肽显示为绿色荧光（图 2-3 B），щ两种荧光可完全重叠（图 2-3 C），直接证实靶向纳米泡表面携载 CAIX 多肽。п携载 CAIX多肽的空白纳米泡和携载无荧光标记的 CAIX 多肽的靶向纳米泡均未显示绿色荧光。

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