放疗诱导的HMGB1在胰腺癌干细胞干性维持中的作用研究

发布时间：2020-08-21 21:32

【摘要】：研究目的:研究放疗后的胰腺癌细胞释放的高迁移率族蛋白B1(highmobility group bo x-1 protein,HMGB1)通过HMGB-TLR2/TLR4信号轴对肿瘤干细胞的增殖及自我更新产生的影响,并进一步探讨其确切分子机制,从而为胰腺癌的放疗增敏、分子治疗及生物靶向治疗提供新思路,为完善胰腺癌的治疗提供有效的实验基础及理论依据。研究方法:(1)采用流式细胞检测技术(Flow Cytometry,FCM)检测不同剂量放疗后的胰腺癌细胞中CD133~+细胞比例随时间变化趋势。Western-Blot检测不同剂量放疗48h后的胰腺癌细胞中CD133、Nanog、Oct4及Sox2等干性相关蛋白的表达变化。(2)Western-Blot及qRT-PCR检测胰腺癌细胞株(SW1990,Pacn-1,Aspc-1)中HMGB1的蛋白及mRNA表达水平。Western-Blot检测不同剂量放疗后胰腺癌细胞中HMGB1的表达变化以及放疗后的细胞培养上清中HMGB1的含量变化。免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测胰腺癌细胞放疗后HMGB1的释放过程。(3)对分别过表达和干扰HMGB1的胰腺癌细胞进行放疗,获取细胞培养上清(s upernatant)用于后续实验。采用干细胞培养体系对胰腺癌细胞进行诱导培养,使用流式细胞分选术分选出其中的CD133~+细胞。使用不同剂量的重组人HMGB1蛋白(rhHMGB1)及细胞放疗后上清分别对胰腺癌CD133~+细胞进行处理,显微镜观察并记录克隆球大小和数目。采用qRT-PCR检测不同处理下细胞干性基因Oc t4、Sox2及Nanog的mRNA表达水平。使用细胞增殖活性检测试剂盒(Cell cou nting kit-8,CCK-8)检测不同处理下胰腺癌CD133~+细胞增殖变化。(4)Western-Blot及qRT-PCR检测胰腺癌细胞中HMGB1受体TLR2/TLR4的表达情况。在高表达TLR2低表达TLR4的细胞中分别干扰TLR2和过表达TLR4,在高表达TLR4低表达TLR2的细胞中分别干扰TLR4和过表达TLR2,Western-Blot检测其在rhHMGB1处理下干性相关蛋白表达变化;克隆形成实验检测其形成克隆能力的变化。(5)Western-Blot检测经rhHMGB1及放疗上清处理后的胰腺癌CD133~+细胞中Wnt信号通路相关蛋白的表达变化。研究结果:(1)流式细胞术结果及Western-Blot结果显示,胰腺癌细胞在放疗后CD133~+细胞比例及干性蛋白的表达均有所增高,并且与放疗剂量和放疗后时间存在相关关系,在4Gy放疗剂量、放疗后48h干性指标增加最明显。(2)Western-Blot及qRT-PCR结果显示不同胰腺癌细胞株内HMGB1表达水平不同,放疗后均有HMGB1释放。(3)成球实验及qRT-PCR结果显示CD133~+细胞在不同浓度rhHMGB1处理后干性明显增强,HMGB1~+-SUP处理时亦能增强其干性,HMGB1~--SUP处理下干性无无明显增强;CCK-8结果显示rhHMGB1(150ng/ml)及HMGB1~+-SUP处理能够增强CD133~+细胞增殖能力。(4)Western-Blot及qRT-PCR结果显示SW1990细胞属于TLR2受体相对高表达TLR4受体相对低表达细胞,Aspc1细胞与之相反,PANC1细胞属于TLR2/4受体中等表达细胞;在SW1990细胞中干扰TLR2或过表达TLR4均能降低其干性蛋白的表达,在Aspc1细胞中干扰TLR4或过表达TLR2均能提高其干性相关蛋白的表达,成球实验亦验证了成球能力的类似改变。(5)Western-Blot结果表明HMGB1对胰腺癌细胞干性的影响是通过Wnt/β-catenin通路起作用的。结论:(1)体外胰腺癌细胞放疗后释放的HMGB1可以提高残存细胞干性比例。(2)外源性HMGB1和细胞放疗后上清可以提高胰腺癌干细胞自我更新的能力。(3)HMGB1通过TLR2/TLR4受体调控Wnt/β-catenin信号通路,从而调控胰腺癌干细胞自我更新能力。为解决临床治疗中胰腺癌对放疗不敏感、易复发转移等问题提供了理论基础。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.9;R730.55
【图文】：

干性,细胞,江苏大学,硕士学位论文

江苏大学硕士学位论文2.3 结果2.3.1 放疗后胰腺癌细胞干性增强流式细胞结果显示：人胰腺癌细胞株（SW1990、Panc1、Aspc1）细胞经过不同剂量放疗，在放疗后的不同时间点，细胞中的 CD133+细胞比例不同，在 4Gy放疗后 48 小时，CD133+细胞比例比对照组及其他组有较明显升高，该现象在SW1990 与 Panc1 细胞比 Aspc1 细胞更为明显；对 Nanog、OCT4、SOX2 蛋白表达水平的检测结果表明：在三种胰腺癌细胞中，4Gy 放疗后 48 小时上述蛋白表达水平明显增高（图 2.1）。

细胞内

盏嫉?HMGB1 在胰腺癌干细胞干性维持中的作用研究22C.D）；免疫荧光结果同样显示放疗后细胞内 HMGB1 从核内释放至细胞外（图2.2 F），统计学结果显示*P< 0.05 ，**P< 0.01，***P< 0.001 时有统计学意义。(A)(B)Western-blot 及 qRT-PCR 检测胰腺癌细胞中 HMGB1 基础表达量(C)(D)Western-blot 检测不同放疗剂量及放疗后时间下细胞内 HMGB1 表达量变化(E)对 D 图的定量结果（左）及 ELISA 检测放疗后不同时间点内上清送 HMGB1 含量(F)免疫荧光检测放疗后细胞内 HMGB1 释放情况图 2.2 放疗导致细胞内 HMGB1 释放至细外Fig2.2 Radiation increased HMGB1 expression and induce

效率,稳定转染,酶联免疫吸附实验,培养基

法吸净原有培养基；②将混匀的 CCK8 试剂与培养基按 100μL/孔加入 96 孔板中，轻轻摇晃混匀，注意不要产生任何气泡，将培养板置于恒温培养箱，静置 2 小时；③使用酶标仪检测每孔中 450nm 及 490nm 处的分光光度值；⑤数据处理：将实验数据减去空白对照组的本底值，再与 0 小时基础值进行比较，计算得到细胞相对增殖率数据。3.3 结果3.3.1HMGB1 稳定敲除效率检测Western-blot 及 qRT-PCR 结果显示，稳定转染干扰 HMGB1 质粒后，三种胰腺癌细胞 SW1990、Panc1 及 Aspc1 细胞中 HMGB1 蛋白及 mRNA 水平均明显减低（图 3.1 A.B）；酶联免疫吸附实验（ELISA）结果显示，稳定转染干扰 HMGB1质粒后，8Gy 放疗后 48 小时检测细胞上清中 HMGB1 含量显著减低（图 3.1 C）；统计学结果显示*P< 0.05 ，**P< 0.01，***P< 0.001 时有统计学意义。

【参考文献】