新型大分子基因载体的构建与评价

发布时间：2020-08-22 02:21

【摘要】：基因治疗作为一种有效低副作用的癌症治疗手段受到广泛关注,安全有效的基因输送载体是其临床应用的关键。基因输送载体分为病毒载体和非病毒载体,非病毒载体主要包括阳离子脂质体、阳离子聚合物以及无机纳米颗粒。其中,树枝状大分子具有结构精确、尺寸可控、表面官能团丰富等特点,是一种独特的阳离子聚合物型基因载体。聚酰基硫脲(PATU)树枝状大分子是本实验室自主设计、高效合成的表面具有大量双键、内部含有抑瘤活性基团的树枝状大分子,硫脲基团的降铜作用是目前被证实的抑瘤机制之一。拟从“协同治疗”角度,构建自身具有抑瘤作用的树枝状大分子基因载体,利用PATU非直接杀伤肿瘤的抑瘤机制克服大多数药物-基因共输送体系存在的严重细胞毒性影响基因表达的问题,以期达到协同治疗效果最大化。论文第一部分通过巯基-烯Michael加成反应得到不同代数的N,N二甲基半胱胺修饰的 PATU(PATU-DMCA)。第二代-第五代(G2～G5)PATU-DMCA 在低N/P比条件下均能够有效包载DNA形成粒径(60～100)nm,电势(10～20)mV的纳米颗粒。在人宫颈癌细胞HeLa上,各个代数的PATU-DMCA无血清荧光素酶(Luci)转染效率优于传统树枝状大分子聚酰胺胺(PAMAM)一个数量级,而有血清转染效率与其相当。HeLa细胞上亚细胞分布情况表明PATU-DMCA纳米颗粒可以通过“质子海绵效应”实现溶酶体逃逸,这对于发挥转染活性是非常有利的。在HeLa腹腔瘤模型中,G4 PATU-DMCA表现出与PAMAM相当的体内Luci转染效率,而其包载TRAIL治疗基因后的治疗效果显著(p0.001),抑瘤率为54.9%。本实验条件下,PATU-DMCA载体组没有表现出抑瘤活性,而PATU-DMCA/TRAIL复合物没有发挥协同治疗效果。从前期工作中PATU-PEG降铜过程分析,可能原因是肿瘤部位结合蛋白中的铜比血清铜蓝蛋白的铜难夺取,且形成的PATU-DMCA/Cu络合物可能无法快速代谢。阳离子脂质体/聚合物在非病毒载体中占有主导地位,而较低的转染效率是影响其应用的主要问题。基于正负静电作用形成的阳离子型载体/核酸纳米复合物热力学上非常稳定,导致难以有效释放核酸。除此之外,阳离子型载体不可避免地易吸附血浆蛋白,导致转染效率降低。对此,大量研究致力于表面遮蔽层及细胞微环境响应性设计减少蛋白吸附以及加快核酸胞内释放,而在非阳离子型载体设计方面的尝试较少。论文第二部分利用siRNA 3'末端二醇结构与苯硼酸之间的硼酸酯键作用设计了非正负电荷作用的siRNA输送体系。通过可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)反应合成得到聚乙二醇-聚丙烯酰胺羟甲基苯硼酸(PEG-PBO)嵌段共聚物,PEG-PBO可以与siRNA自组装形成粒径90nm的交联体系,进一步加入Ca~(2+)和HPO_4~(2-)离子得到CaP核-PEG壳结构的纳米颗粒,其中PEG遮蔽层可以有效控制CaP生长。PEG-PBO/siRNA/CaP纳米复合物具有高达94%的包载效率,低细胞毒性,且中性pH条件下可以保持高稳定性。在多种细胞系中,PEG-PBO/siRNA/CaP纳米复合物表现出优于Lipo2000的绿色荧光蛋白/荧光素酶基因沉默效率和BCL-2 mRNA下调作用。同时,包载BCL-2 siRNA治疗基因的纳米复合物在细胞水平具有显著促凋亡效果且可以有效提高化疗药物吉西他滨/紫杉醇的细胞毒性。内吞抑制剂实验表明PEG-PBO/siRNA/CaP纳米复合物主要以网格蛋白介导的内吞途径进入细胞,到达内涵体/溶酶体。在酸性内涵体/溶酶体中,pH敏感的硼酸酯键发生断裂,核壳结构迅速分解,从而钙离子迅速溶解,导致溶酶体渗透性膨胀破裂,siRNA释放到细胞质中发挥后转录沉默活性。尝试将PEG-PBO/siRNA/CaP体系应用于体内基因输送,结果表明纳米复合物血浆清除速度快,无法在肿瘤部位蓄积,导致体内几乎没有沉默效果。纳米复合物在葡萄糖缓冲溶液中的粒径迅速增大的实验结果推测,纳米复合物静脉注射进入血液后,血液中的糖类物质的二醇结构会竞争络合PEG-PBO,导致纳米颗粒很容易散开,很快被肝脏、肾脏清除代谢。同时,羟甲基苯硼酸与CaP纳米颗粒之间具有强吸附作用,因此,PEG-PBO也可以作为CaP、DNA共沉淀体系的稳定剂,所形成的PEG-PBO/DNA/CaP纳米复合物粒径为200 nm左右,电势为(-6～-4)mV。细胞毒性实验表明在有血清培养基中,PEG-PBO/DNA/CaP纳米复合物对HeLa和A549细胞几乎没有毒性。当Ca~(2+)/HPO_4~(2-)为20时,纳米复合物的荧光素酶转染效率达到最大值,其无血清值与PEI相当,有血清值是PEI的100～1000倍。与大多数阳离子载体不同,纳米复合物在有血清条件下的转染效率高于无血清转染值,表现出一定的抗血清性。这一特点在PEG-PBO/siRNA/CaP体系也有体现。体外稳定性实验表明PEG-PBO/DNA/CaP纳米颗粒在48h内粒径有所增大,其稳定性差于具有硼酸酯键络合作用的siRNA输送体系,有待进一步提高。综上所述,论文对两种新型大分子基因载体—聚酰基硫脲和PEG-PBO稳定化的CaP纳米颗粒—进行了初步探索,取得了一些积极的结果,但在发挥聚酰基硫脲本身抑瘤活性和提高稳定性方面,两个体系需要进一步优化。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R450
【图文】：

Ｔｈ？邋Ｊｏｇｒｎａｌ邋ｏｆ邋Ｇ？ｎ？邋Ｍｔｄｉｃｉｎ＊．邋＆邋２０１８邋Ｊｏｈｎ邋Ｗｉｌ？ｙ邋ｏｎｄ邋Ｓｏｎｓ邋Ｕｄ逡逑图１．１基因治疗临床试验病例统计［３］逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ邋ａｄｄｒｅｓｓｅｄ邋ｂｙ邋ｇｅｎｅ邋ｔｈｅｒａｐｙ邋ｃｌｉｎｉｃａｌ邋ｔｒｉａｌｓ逡逑输送逡逑

阳离子脂质体通常会与辅助脂质体如ＤＯＰＥ、胆固醇等混合使用以提高逡逑压缩能力和转染效率。ＤＯＰＥ不仅可以促进脂质体结构的形成，而且有利于核酸逡逑的溶酶体逃逸，而胆固醇可以稳定结构以及延长血液循环时间。（图１．２）逡逑阳离子脂质体一般具有三个功能区域：（１）极性亲水阳离子头端，用于与核逡逑酸反应；（２）疏水性尾端，用于和细胞膜作用；（３）头尾之间的连接部分。正电逡逑性的头端通常是胺类，季铵盐，胍类或者氨基酸。它们决定了脂质体和核酸磷酸逡逑基团的作用强弱。较多的胺官能团以及官能团间较大的距离有利于转染，疏水尾逡逑端的长度以及化学结构对转染效率影响很大。逡逑Ｎ－［ｌ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｖ）ｐｒ0ｐｙＪ］－ＮｆＮ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ逦１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ逡逑（ＤＯＴＭＡ）逦、（ＤＯＰＥＪ逡逑，0逡逑ｌ

阳离子脂质体通常会与辅助脂质体如ＤＯＰＥ、胆固醇等混合使用以提高逡逑压缩能力和转染效率。ＤＯＰＥ不仅可以促进脂质体结构的形成，而且有利于核酸逡逑的溶酶体逃逸，而胆固醇可以稳定结构以及延长血液循环时间。（图１．２）逡逑阳离子脂质体一般具有三个功能区域：（１）极性亲水阳离子头端，用于与核逡逑酸反应；（２）疏水性尾端，用于和细胞膜作用；（３）头尾之间的连接部分。正电逡逑性的头端通常是胺类，季铵盐，胍类或者氨基酸。它们决定了脂质体和核酸磷酸逡逑基团的作用强弱。较多的胺官能团以及官能团间较大的距离有利于转染，疏水尾逡逑端的长度以及化学结构对转染效率影响很大。逡逑Ｎ－［ｌ－（２，３－ｄｉｏｌｅｙｌｏｘｖ）ｐｒ0ｐｙＪ］－ＮｆＮ，Ｎ－ｔｒｉｍｅｔｈｖｌａｍｍｏｎｉｕｍ逦１，２－ｄｉｏｌｅｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ逡逑（ＤＯＴＭＡ）逦、（ＤＯＰＥＪ逡逑，0逡逑ｌ

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本文编号：2800142