光响应性仿生纳米基因传递载体的构建及表征

发布时间：2020-08-24 15:28

【摘要】：基因疗法的快速发展给人类多种疾病带来了治愈的希望,并且在肿瘤治疗领域中已成为一种最具有发展前景的治疗手段。然而,如何将治疗基因聚集到靶器官进行特异性表达,从而达到提高治疗效果降低脱靶效应等副作用,一直是限制基因治疗临床应用的最重要因素。因此,设计并制备高效基因递送载体实现治疗基因的靶向递送和有效表达具有重要意义。在前期研究中,本课题组曾模拟病毒基因传递载体的结构特点,构建得到基于多糖的仿生纳米囊泡基因传递载体。该仿生基因传递载体不仅能够有效避免体内网状内皮系统的清除,在肿瘤组织进行富集,而且可以被肿瘤细胞高效摄取,显著提高治疗基因的体内转染效率。但是,如何实现治疗基因的可控性表达尚未解决。基于此,本论文结合前期研究基础,在仿生多糖纳米囊泡基因传递载体的结构中引入光热剂Au,设计并合成了一种光响应性的高生物相容性仿生纳米囊泡HTCP-Au,用于实现肿瘤的可控性基因治疗。本论文的研究内容主要包括以下几个方面:(1)HTCP-Au的合成和体外表征。首先将透明质酸(hyaluronic acid,HA)通过酰胺键依次连接12-氨基十二烷酸,L-半胱氨酸(L-cysteine,L-Cys)构建得到HA-C_(12)-Cys;接着将聚乙烯亚胺(polyethyleneimine,PEI)连接至HA-C_(12)-Cys的末端得到HTCP,最后利用L-Cys中的巯基与Au进行Au-S键结合,构建得到HTCP-Au。利用核磁共振氢谱、红外光谱、元素分析对载体的结构进行表征,通过透射电镜、动态激光光散射及圆二色谱实验进行形态学表征。实验结果表明HTCP-Au构建成功。除此之外,DNA凝胶阻滞实验表明HTCP-Au具有核酸负载能力;光热转换效应实验表明HTCP-Au具有体外光响应能力。(2)体外细胞实验。以乳腺癌细胞株MCF-7和4T1作为细胞模型考察HTCP-Au的生物相容性、细胞摄取、细胞转染及光热转化性能。细胞增殖率、细胞周期和细胞凋亡结果表明HTCP-Au与HTCP-Au/DNA没有明显的细胞毒性。流式细胞检测结果显示,HTCP-Au,HTCP-Au/DNA细胞摄取率在6 h就已达到95%以上,且细胞摄取与clathrin介导的内吞作用有关。光热转换实验显示,使用808 nm近红外光照射转染HTCP-Au的乳腺癌细胞,可以显著提高细胞温度,这进一步表明HTCP-Au载体具有光响应性。(3)体内动物实验。以荷S180腹水瘤的BLAB/C雌性小鼠为模型考察光响应性基因递送载体HTCP-Au的组织相容性、体内分布及光热转换活性。体外溶血实验与红细胞凝聚实验显示,HTCP-Au/DNA在体内的溶血率低于5%,未见有明显的细胞聚集情况,表现出了良好的血液相容性。基于小鼠血液及肝功能生化指标、小鼠的体重变化、脏器系数、病理组织切片、ICP-MS的实验结果显示,HTCP-Au具有良好的生物相容性,未见明显的体内毒性。体内材料组织分布与小鼠的活体成像实验结果共表明HTCP-Au/DNA主要在肝脏和肿瘤组织蓄积,具有肿瘤靶向性。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R450
【图文】：

示意图,路线,示意图,傅里叶红外光谱

8图 2. 1 HTCP-Au 的合成路线示意图Figure 2.1 Synthesis procedure of HTCP-Au3.4 质子核磁共振波谱称量 0.0150 g 待测样品，溶解于 0.55 mL 氘代水，置于核磁管中，采核磁共振氢谱（Nuclear magnetic resonance hydrogen spectrum，1H-NM3.5 傅里叶红外光谱称取约 2 mg 待测样品粉末，与 100~200 mg KBr 粉末混合研磨，在片制片，使用傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared Spectrometer行样品光谱采集。3.6 粒径、电位测定

谱图,分散性,溶液,质子

CP 在不同溶液中的分散性(A)、Au NPs (B)及 HTCP-Au (C)溶液 Dispersibility of HTCP in different solutions (A), Au NPs (B) and Hsolution.核磁共振波谱磁共振氢谱中的质子峰及其化学位移等信息，可以初步L-Cys、PEI 是否成功接枝在多糖骨架上，实验结果见图，HA-C12-Cys 的核磁谱图在化学位移 1.0-1.6 ppm 和 2.9质子峰，分别为 12-氨基十二烷酸中的-CH2-CH2--CO-NH-CH2-的质子峰，在化学位移 2.8 ppm 出现的质子峰，这表明 HA-C12-Cys 成功构建；与 HA-C12-Cys 谱图在化学位移 2.5-3.5ppm 处出现新峰，为 PEI 中的-NH-C明 PEI 成功接枝到 HA-C12-Cys。

谱图,核磁共振氢谱

图 2. 3 HTCP (a)、HA-C12-Cys (b)、HA (c)的核磁共振氢谱图Figure 2. 3 The1HNMR spectrum of HTCP(a), HA-C12-Cys (b) and HA(c).4.3 傅里叶红外光谱利用傅里叶红外光谱法进一步对载体 HTCP-Au 进行结构表征，实验结果 2.4。在 HA 的 FT-IR 图中，3360 cm-1处的吸收峰是 HA 分子内羟基通过分或者分子内氢键缔合产生的特征吸收峰；1640 cm-1和 1375cm-1的强锐峰为的特征吸收峰；1227 cm-1和 1150 cm-1处的特征吸收峰为糖环的特征吸收峰 HA 谱图相比，HA-C12-Cys 在 1733.31 cm-1处出现新峰，此为 L-Cys 的羧基=O 的特征峰。在波长 2850.23 cm-1和 1462 cm-1处分别出现新的吸收峰，此CH2-CH2-的特征峰，而且 2920.73 cm-1处峰强增加，且峰形变窄。而 HTCP400 cm-1左右出现了新峰，此为 PEI 中的-NH2峰。连接 Au NPs 后，光谱的率明显降低，但仍保持有原有的特征峰。FT-IR 光谱结果进一步证实 PEIu NPs 已通过 12-氨基十二烷酸，L-Cys 成功接枝到 HA，构建得到纳米载TCP-Au。

【参考文献】