基于氧化铁纳米粒子磁弛豫传感与自组装钆剂MRI成像的致病菌分析

发布时间：2020-08-27 20:59

【摘要】：由致病菌引起的感染性疾病严重威胁人类健康。由于复杂生物样本中背景信号的干扰,比色、荧光、散射光等方法在进行复杂生物样本(如全血、活体组织等)中致病菌快速分析时表现出不足。因此发展快速准确检测复杂样本中致病菌的方法对感染性疾病的诊治具有重要意义。超顺磁性氧化铁纳米材料独特的磁分离、磁共振等性能,使其被广泛应用于小分子、蛋白、核酸、细胞等的富集和磁弛豫传感分析等方面。顺磁性材料钆螯合物由于其高磁弛豫效能,常被作为磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)造影剂广泛应用于细胞、肿瘤、心血管疾病成像与诊断方面。本工作以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)为致病菌研究模型,基于氧化铁纳米粒子浓度变化(与靶标菌结合后被磁分离除去)引起水质子弛豫时间T_2发生变化的原理构建磁弛豫传感器用于复杂样本中致病菌分析;基于抗生素、功能化多肽和钆剂构建靶向自组装MRI造影剂,用于复杂样本中致病菌成像分析。其主要内容如下:第一部分:基于氧化铁纳米粒子构建磁弛豫传感器检测金黄色葡萄球菌。以猪源免疫球蛋白IgG修饰粒径为30 nm的氧化铁纳米粒子制备T_2信号探针(IgG-MB_(30nm)),以肽聚糖特异性抗体(Antibody,Ab)修饰粒径为200 nm的氧化铁纳米粒子制备捕获探针(Ab-MB_(200nm))。由于IgG和Ab对S.aureus的双识别作用,IgG-MB_(30nm)和Ab-MB_(200nm)能与S.aureus特异性结合形成夹心复合物,复合物经磁分离除去后,溶液中IgG-MB_(30nm)浓度降低。因此通过溶液中IgG-MB_(30nm)的浓度变化引起的T_2变化从而实现S.aureus的定量检测。研究表明,该方法检测范围为10~5-10~7cfu/mL,检测限为10~4 cfu/mL。非靶标菌大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,S.typh)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,B.subtilis)不干扰检测信号。进一步研究表明,该方法对全血复杂样本中S.aureus的回收率为94.3%-103.3%,具有较高的回收率。同时该传感器可用于小鼠脓肿样本中S.aureus的检测。由于磁信号可忽略生物样本的散射、吸收或自发荧光的背景干扰,因此基于该磁弛豫传感器有望对其他复杂生物样本中S.aureus进行检测,并为致病菌感染性疾病诊断提供技术支持。第二部分:基于抗生素、功能化多肽和钆剂构建自组装MRI造影剂用于靶向金黄色葡萄球菌体外成像。由于万古霉素(Vancomycin,Van)能与S.aureus细胞壁成分D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)特异性结合,同时S.aureus能诱导多肽FFYEGK通过苯丙氨酸与苯丙氨酸的π-π堆积作用在S.aureus表面形成自组装体。因此利用Van和自组装多肽(FFYEGK)制备的多功能钆造影剂(Gd-FFYEGK-Van)可实现S.aureus靶向成像。研究表明,制备的Gd-FFYEGK-Van造影剂弛豫率为5.74 mM~(-1)·s~(-1),使其具有优良的MRI成像性能。同时该MRI造影剂可成功靶向S.aureus,并且在S.aureus表面发生自组装形成聚集体,有望放大革兰氏阳性菌感染部位MRI检测信号。因此该造影剂在深部组织致病菌感染性疾病的成像和诊治方面具有潜在的临床应用价值。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TB383.1;R445.2;TQ138.11
【图文】：

乳铁蛋白,免疫传感器,致病菌,探针

西南大学硕士学位论文法可以通过视觉上颜色变化检测不同的病原体。乳铁蛋白固定化棉用于识别捕获各种病原体，随后将棉花浸入特异性抗体修饰的不同颜色纳米球以特异检测细菌。通过该方法，可检测到低至 10 cfu/mL 的鼠伤寒沙门氏菌和空肠弯曲杆菌，100cfu/mL 的肠炎沙门氏菌和 100 cfu/mL 的鸡肉表面上的金黄色葡萄球菌。此外，进一步通过环介导的等温扩增（LAMP）证实该方法具有高选择性。该比色传感器的简单性和低成本使其适用于不同病原体的检测。Tan Yueming15等采用溶解法合成含铜金属有机框架 Cu-MOF，该纳米颗粒具有过氧化物酶活性，可催化 3,3',5,5'-四甲基联苯胺在 H2O2存在下发生黄色显色反应（见图 1-1B）。适配体 aptamer 修饰的 Cu-MOF 纳米颗粒作为信号分子，适配体修饰的磁珠作为捕获分子用于捕获S.aureus，将 Cu-MOF 催化显色反应与适配体识别和磁分离相结合，建立了一种简便、灵敏、选择性好的 S.aureus 检测方法。该方法检测范围为 50-10000 cfu/mL，检测限为 20 cfu/mL。

示意图,策略,示意图,适配体

第一章绪论双识别 FRET 策略快速准确检测金黄色葡萄球菌的方法（见图 1-2B）。以抗生素万古霉素（Vancomycin，Van）修饰的金纳米簇（AuNCs）作为荧光供体，适配体（aptamer）修饰的纳米金（AuNPs）作为荧光受体，基于荧光共振能量转移技术一步法检测S.aureus。该双识别策略可在 30 分钟内特异性检测浓度范围为 20-108cfu/mL 的S.aureus，检测限为 10 cfu/mL。

示意图,抗菌肽,发光法,背景信号

Ds@BONs49(A)和 Van-AuNCs，aptamer-AuNPs 双识别策略50(B示意图atic illustration of S.aureus detection based on CDs@BONs (A) and strategy of Van-AuNCs and aptamer-AuNPs (B).发光法（CL）光法（Chemiluminescentmethod，CL）具有背景信号低，等优点，因此被广泛应用于构建传感器检测病原菌。

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