单核细胞增生性李斯特菌可视化检测方法的建立与评价

发布时间：2020-09-03 08:28

　　单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一种常见的食源性致病菌。近年来,由该菌引起的食品安全事件频繁发生,严重威胁着人类的健康和社会经济的发展。该菌可感染人和动物引发李斯特菌病。临床症状为脑炎、脑膜炎、败血症等,病死率较高。因此,对其进行现场监控与快速准确检测已成为公共卫生检测领域的研究热点问题之一。目前,单增李斯特菌的实验室检测方法,主要有传统分离培养生化鉴定法、免疫学检测方法和分子生物学检测方法,这些方法均存在着耗时长、灵敏性低、对实验条件和操作人员要求较高等不足。因此开发具有操作简单、快速、灵敏的单增李斯特菌检测新方法,对于李斯特菌病的防控工作具有重要的意义。本课题研究旨在依据单增李斯特菌的结构性质和致病机制,将分子生物学技术,纳米技术相结合,构建针对食品中单增李斯特菌的快速、灵敏、简便的可视化检测方法。为环境生物毒素研究提供新思路和新方法,也为食品安全的现场检测提供技术支持。主要研究内容包括以下四个部分:第一部分单增李斯特菌鸡卵黄抗体IgY的制备及纯化鉴定(1)以单增李斯特菌灭活菌悬液,分别制备弗氏完全佐剂疫苗和弗氏不完全佐剂疫苗。采用皮下多点注射法将疫苗接种于鸡胸处皮下,收集免疫前后鸡蛋,采用聚乙二醇沉淀法提取卵黄抗体,采用凝胶过滤层析法对卵黄抗体IgY进行分离纯化,采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对所得抗体IgY进行纯度鉴定。结果显示,纯化前的IgY除目标链之外出现多条杂带,纯化之后的IgY仅有目标链显现,表明纯化后抗体纯度较高。(2)采用BCA蛋白定量试剂盒测定卵黄抗体蛋白含量。经测定所提取IgY的蛋白含量范围为5.51-22.89mg mL~(-1),第15周所提取的IgY的蛋白含量最高,为22.89 mg·mL~(-1)。(3)采用常规间接ELISA方法对所提取IgY的抗体滴度和特异性进行测定。结果显示,随着免疫时间的增加,抗体滴度呈逐渐上升趋势,第9周时,抗体滴度达到最大,即1:512000,随后趋于平稳,在第15周后有所下降,但依然处于高水平状态;特异性结果表明,所制备卵黄抗体IgY与常见的5种食源性致病菌均没有交叉反应,特异性高。第二部分基于OPD-AuNPs检测体系的单增李斯特菌可视化检测方法研究(1)本部分实验采用溶剂热法,合成Fe_3O_4磁性纳米粒子,并制备单增李斯特菌适配体标记免疫磁纳米探针,作为捕获探针,以BSA为模板,制备纳米酶IgY-BSA-AgNCs免疫探针,作为检测体系的“信号转导器”,采用柠檬酸钠还原法,制备AuNPs,作为检测体系的“显色信号器”。基于OPD-AuNPs反应和IgY-BSA-AgNCs介导催化氧化OPD反应,建立单增李斯特菌可视化检测体系。结果显示,捕获探针在0.6 mg时,捕获效率高达96.1%,IgY-BSA-AgNCs探针为10.0μg mL~(-1),OPD浓度为40 nM时,检测体系的效果达到最佳。(2)对该检测体系进行效果评价。灵敏度结果显示,该检测体系对单增李斯特菌检测时间为40 min,可视化检测限为1×10 CFU mL~(-1),经A525处的紫外吸收值建立的线性拟合曲线为A525nm=0.102lgC+1.014,R~2=0.998,该结果表明建立的检测方法具有较好的线性关系;特异性结果显示,该检测体系与其他4种常见的食源性致病菌之间无交叉反应,特异性强;食品模拟样结果显示,可视化检测限为5×10 CFU mL~(-1),线性拟合曲线为A525nm=0.144lgC+0.726,R~2=0.914,此结果表明食品基质对该检测方法的干扰性小,可在食品基质中灵敏的检测目标菌,加标回收实验结果显示,该检测体系加标回收率为97.4-101.3%,RSD在10%以下,这表明本实验建立的检测体系稳定性强,精密度较好。相比于同类比色检测方法,该检测体系具有高效富集,快速灵敏检测的优势。第三部分基于CB7-AuNPs检测体系的单增李斯特菌可视化检测方法研究(1)本部分制备单增李斯特菌适配体和尿素酶双标记免疫磁纳米探针,作为检测体系的捕获探针,以AuNPs作为检测体系的“信号器”,基于CB7-AuNPs的自主装作用和尿素酶水解尿素反应建立单增李斯特菌可视化检测体系。结果显示,免疫磁纳米探针在0.5 mg时,对目标菌富集效率为90.9%,10μL 0.86μM CB7量时,检测体系效果最好。(2)对建立的单增李斯特菌可视化检测体系进行效果评价。结果显示,该检测体系对单增李斯特菌可视化检测限为1×10 CFU mL~(-1),检测时间为50 min,以A700/A525比值处理数据,经计算,在1×10-1×10~6 CFU mL~(-1)浓度范围内,线性回归曲线为y=0.0903lgC+0.06798,R~2=0.986,表明本实验建立的检测方法具有良好的线性关系;特异性结果显示,该检测体系将目标菌与其他4种常见的食源性致病菌同时进行检测,仅在目标菌存在时,显示阳性结果,特异性强;食品模拟样结果显示,可视化检测限为1×10~2 CFU mL~(-1),线性回归曲线为y=0.1048lgC+0.5541,R~2=0.940,此结果表明该检测方法可在食品基质中灵敏的检测目标菌,加标回收实验结果显示,该检测体系加标回收率为97.2-99.6%,RSD在10%以下,说明本实验建立的检测体系稳定性好,精密度高。与其他比色检测方法相比,此检测体系具有操作简单,快速灵敏的独特优势。第四部分基于多色比色法的单增李斯特菌快速检测方法研究(1)本部分实验以免疫磁纳米探针作为“分离器”,以BSA为模板,制备IgY-BSA-MnO_2免疫探针,作为“信号转换器”,以合成的AuNRs作为多色“信号器”,基于IgY-BSA-MnO_2催化氧化TMB反应和TMB~(2+)-AuNRs刻蚀反应建立多色比色检测体系。条件优化结果显示,0.6 mg的免疫磁纳米探针,28μg的IgY-BSA-MnO_2免疫探针使检测体系多色显示效果最优。(2)检测体系的效果评价结果显示,该检测体系对单增李斯特菌检测时间为45 min,可视化检测限为1×10 CFU mL~(-1),以AuNRs纵向LSPR的蓝移峰差值做标准曲线,Δλ=61.364lgC-88.539,R~2=0.932;特异性效果评价显示,所构建的多色半定量检测体系抗杂菌干扰性强;食品模拟样结果显示,在5×10-10~5CFU mL~(-1)范围内,线性回归曲线为Δλ=25.038lgC-31.388,R~2=0.992,这表明该检测方法可快速灵敏的检测食品基质中的目标菌,该检测体系加标回收率为97.4-102.4%,RSD在10%以下,精密度较好。本研究首先基于OPD-AuNPs反应和IgY-BSA-AgNCs介导催化氧化OPD反应,建立的单增李斯特菌可视化检测体系,使其具有捕获效率高,检测限低,特异性强,检测时间短等优点;为达到简便、灵敏、快速检测单增李斯特菌的目标,本研究进一步以CB7-AuNPs的自主装作用和尿素酶水解尿素反应建立的单增李斯特菌可视化检测体系,该体系具有操作简单,快速,灵敏的优良性质;在此工作基础上,为实现可视化半定量检测目标菌的目的,本研究又利用IgY-BSA-MnO_2催化氧化TMB反应和TMB~(2+)-AuNRs刻蚀反应建立多色比色可视化检测体系。多色的颜色变化和半定量测定目标菌的性质,使该检测体系在其他比色检测方法中,具有可视化半定量目标菌的特点,在半定量检测目标物方面,具有绝对的优势。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R155.3;R446.6

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