EV71型和CA16型病毒卵黄抗体的制备及其在临床检测中的应用

发布时间：2020-09-03 19:42

　　研究目的:手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)是由多种肠道病毒引起的常见传染病,我国手足口病暴发流行的主要病原体为肠道病毒71型(Enterovirus71,EV71)和柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CA16),由于该病毒对人群健康危害较大,因此,早期快速、特异性地监测EV71、CA16病原体并采取有针对性的预防控制措施,现已成为公共卫生研究的热点问题之一。传统的检测方法存在操作复杂、耗时耗力、灵敏度低、特异性差等缺点。因此,建立一种快速、灵敏且特异性好的手足口病检测方法十分必要。本课题旨在制备EV71、CA16型病毒卵黄抗体,并对其纯度、蛋白含量、效价和特异性等指标进行效果评价;通过静电自组装将卵黄抗体偶联至金纳米粒子表面以制备能够特异性识别EV71、CA16的生物探针,基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)技术,建立一种手足口病的快速检测方法,构建EV71、CA16两种手足口病病原体检测试剂盒,在实际检测工作中,仅需将经预处理后的待检样本分别加入不同荧光淬灭体系中,即可实现一步检测,应用于临床样本检测中,并对该法的检测效果进行评价。研究方法:本课题成功制备了EV71型和CA16型病毒卵黄抗体,并对这两种抗体的纯度、蛋白含量、效价、特异性进行鉴定;基于鸡卵黄抗体和FRET技术,建立手足口病的快速检测方法并应用于临床样本检测中,对建立的检测方法进行效果评价。具体研究内容如下:1.采用灭活病毒作为抗原,免疫SPF级产蛋母鸡,收集鸡蛋,采用聚乙二醇沉淀法分离提取鸡卵黄抗体;采用SDS-PAGE方法及蛋白浓度定量试剂盒(BCA)方法测定抗体纯度及蛋白含量;采用间接ELISA(iELISA)方法检测抗体效价和特异性;2.将上述制备的EV71、CA16鸡卵黄抗体通过静电自组装与金纳米粒子偶联,制备可以特异性识别EV71、CA16的金纳米生物探针。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)、紫外可见光谱(UV-Vis)、透射电子显微镜(TEM)、动态光散射(DLS)和ZETA电位(Zeta potential)对金纳米生物探针的组成、尺寸、形貌和性能进行表征。3.基于鸡卵黄抗体和FRET技术构建手足口病临床检测体系。应用上述制备的金纳米生物探针和量子点构建荧光淬灭体系,加入不同浓度的待检病毒后,采用荧光分光光度计检测体系荧光值,建立荧光强度与病毒浓度的线性回归方程,从而实现手足口病临床样本的定性、定量检测。通过优化检测体系IgY-AuNPs用量、NaCl用量、荧光恢复时间等指标,对检测方法的灵敏度、特异性进行评价,构建EV71、CA16两种手足口病病原体检测试剂盒,在实际检测工作中,仅需将经预处理后的待检样本分别加入不同荧光淬灭体系中,即可实现两种病原体的定性、定量检测,满足手足口病临床样本的快速筛查和检测的实际需要。研究结果:1.本实验制备的EV71、CA16型病毒卵黄抗体纯度较好,轻重链分明,条带清晰,无其他明显杂带;EV-71-IgY平均蛋白含量为26.60 mg·L~(-1),抗体最高效价为1:512000;CA-16-IgY平均蛋白含量为12.15 mg·L~(-1);抗体最高效价为1:128000;两种鸡卵黄抗体特异性均良好,能特异性识别靶病毒而不与干扰物结合。2.基于EV-71-IgY和FRET原理,建立EV71型手足口病病原体检测方法。经优化实验条件,确定EV-71-IgY-AuNPs的最佳用量为350μL(1.3×10~(-4) g·mL~(-1)),最佳荧光恢复时间为60 min。在最优实验条件下,测定本方法的线性检测范围为10~4 PFU·mL~(-1)~5×10~6 PFU·mL~(-1)。根据检测体系荧光值与病毒浓度呈线性关系,计算得标准曲线为I_(638nm)=24.364C-59.168,R~2=0.9836,判定检出限为10~4PFU·mL~(-1),且检测方法特异性良好,与CA16病毒无交叉反应;同时,将本方法应用于手足口病临床粪便样本检测,实验结果与EV71病毒标准检测方法qRT-PCR对比分析,检测方法的一致率达到90%,表明本研究建立的检测方法可应用于临床样本的检测。3.基于CA-16-IgY和FRET原理,建立CA16型手足口病病原体检测方法。经优化实验条件,确定CA-16-IgY-AuNPs的最佳用量为400μL(1.3×10~(-4) g·mL~(-1)),最佳NaCl用量为40μL(2 mol·L~(-1)),最佳荧光恢复时间为90 min;在最优实验条件下,测定本方法的线性检测范围为10~4 PFU·mL~(-1)~2×10~6 PFU·mL~(-1)。根据检测体系荧光值与病毒浓度呈线性关系,计算得标准曲线为I_(525nm)=15.452IgC-9.746,R~2=0.9932,判定检出限为10~4 PFU·mL~(-1),且检测方法特异性良好,与EV71病毒无交叉反应;同时,将本方法应用于手足口病临床粪便样本检测,实验结果与CA16病毒标准检测方法qRT-PCR对比分析,检测方法的一致率达到93.75%,表明本研究建立的检测方法可应用于临床样本的检测。研究结论:1.成功制备了EV71、CA16型病毒卵黄抗体,且抗体质量良好。2.成功制备了IgY-AuNPs,并对其尺寸,形貌和性能进行了表征。3.成功建立了EV71、CA16型手足口病检测方法,制备了EV71、CA16两种手足口病病原体检测试剂盒,仅需将经预处理后的待检样本分别加入不同荧光淬灭体系中,即可实现一步检测,该检测方法效果良好,可以满足手足口病临床样本的快速筛查和检测的实际需要。
【学位单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R725.1;R446.6

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