基于核酸适配体的外泌体分离检测新方法的研究
发布时间：2020-09-16 13:57
外泌体是大多数细胞都会分泌的一种微小囊泡,其直径在30～150 nm之间,携带着其来源细胞的功能核酸、蛋白质等信息,最初它被认为是细胞排泄废物的一种方式,近年来越来越多的研究表明外泌体是细胞间通讯交流的一种载体,与细胞的众多生理学和病理学功能相关,此外,外泌体还参与了肿瘤微环境的形成。因此,外泌体在疾病诊断、治疗及预后过程中发挥着举足轻重的作用。而目前还没有形成规范的、统一的外泌体的分离和检测技术,现存的方法都或多或少存在不同的缺陷,因此,本文针对目前外泌体分离及检测过程中存在的问题,开发了两种外泌体检测的新方法,一种通过双重信号放大技术实现对血清样本中外泌体的高灵敏度检测,另外一种方法创新性的将滚环扩增技术应用于外泌体的分离,实现了外泌体的分离、检测以及蛋白分析一体化操作,为外泌体研究提供了一种新的思路。主要研究内容如下:1、利用双重信号放大技术对肝癌细胞HepG2来源的外泌体进行高灵敏度检测。在这项工作中,我们利用适配体的灵活性设计了一种外泌体定量方法,将外泌体捕获事件转化为核酸检测。利用发夹DNA级联反应(HDCR)和DNA树突状分子自组装实现了双重信号放大。CD63适配体和其封闭探针通过链霉亲和素连接到磁珠上,作为捕获元件。在目标外泌体存在的情况下,适配体识别并与外泌体结合,释放封闭探针作为启动HDCR(第一个信号放大过程)的引发链,打开AuNP(AuNPs)表面固定的发夹DNA(HP1)。荧光标记的DNA树突状大分子与HP1连接作为第二级信号放大,由此提高信噪比。在最优条件下,我们的方法对HepG2细胞来源的外泌体取得了良好的线性响应,线性浓度范围在1.75×1O3～7.0×106粒子/μL,检测极限为1.16×103粒子/μL。另外,我们的方法对生物样品中外泌体的检测也显示出良好的性能。2、构建DNA-AuNP-Exo网络结构实现低离心转速的外泌体分离、检测以及蛋白分析一体化。利用滚环扩增反应(RCA)产生包含多个功能域的长链DNA发夹结构,该长链DNA由多个CD63适配体区、连接区、间隔区组成,由碱基互补配对折叠形成发夹结构。当CD63适配体与外泌体结合后,发夹结构构象改变,暴露出连接区(AuNP结合序列),通过toehold介导的链置换反应,AuNP上的探针与该长链DNA的连接区结合,释放荧光标记的互补探针,产生检测信号,同时形成DNA-AuNP-Exo网络结构,可通过低速离心实现对外泌体的分离。我们通过透射电镜和共聚焦荧光显微镜证实了DNA-AuNP-Exo网络结构的形成。此外,我们建立了荧光比率和外泌体浓度对数的标准曲线,并通过LC/MS对分离的外泌体进行了蛋白谱分析,质谱得到的蛋白质数量和超速离心法得到的蛋白质数量非常接近。
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.1
【部分图文】：
囊泡（ＥＶｓ）有多种类型，从它们的大小和产生机制来说主要包括三类：外泌体（直径逡逑小于１５０ｎｍ）、微泡或脱落颗粒以及凋亡体，后两者直径都大于ｌＯＯｎｍ，并且直接由质逡逑膜释放。而外泌体的生成过程则不同｜１３１，如图１．１所示首先由细胞膜向内生芽形成逡逑早期内体，然后早期内体转运至多呿泡小体（ＭＶＢ），有的多囊泡小体和溶酶体融合后逡逑会将内容物降解，有的多迤泡小体可以与质膜融合释放小囊泡（外泌体）到细胞外部。逡逑在外泌体生成的后期，ｉｌｌ邋ＲａｂＧＴＰａｓｅｓ２７Ａ和２７Ｂ介导多囊泡小体与质膜融合Ｗ。逡逑Ｃ，Ｔ０Ｓ０１邋＇逡逑ＭＶＢ逡逑！（奋）一⑩，Ｍ，＿逡逑＇ｖ邋逦逦邋＾逦、逡逑‘逦Ｍ邋？ｃ’ｏｙ？逦Ｉｍｍｕｎｏ邋ｒ？ｆｔ？ｌａｔｅ／逡逑……．？？参：ｅＳＱＱＦ＾逡逑ｃｅｌｌ逦响逡逑Ｌ＿逦１——二逡逑图１．１外泌体的组成和分泌。逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．逡逑目前，可体外培养的细胞几乎都可以产生外泌体，外泌体的来源广泛，在血液、唾逡逑液、尿液、羊水、腹水、乳汁等众多体液以及细胞培养上清液中都能检测到外泌体。外逡逑泌体的粒径（３０？１５０邋ｎｍ）比较小，在电子显微镜视野下才能观察到外泌体的杯状结构。逡逑由于外泌体是细胞分泌的囊泡
１．２．１超速离心法逡逑离心法是利用细胞、囊泡亚群和蛋白质之间的大小差异进行分离的。差速离心法是逡逑目前外泌体分离的金标准，包括一系列逐步提速的离心步骤［５５］。图１．２给出了超离心的逡逑工作流程示意图［５６］，据统计，在所有外泌体研宄中，超速离心法占５６％。使用标准离心逡逑法（＜２００００ｇ）可以分离大的组分包括细胞、凋亡小体和大的囊泡，而从蛋白混合物中逡逑分离外泌体则需要使用超速离心法ＯｌＯＯＯＯＯｇ）。超高的转速、较长的运行时间（？５ｈ）逡逑以及需要严格的技术培训是其主要缺点［５７１。此外，超速离心法常常导致外泌体回收率（５％逡逑？２５％）较低ｔ％，并且经常与蛋白聚集物一起沉淀下来。此外，这种方法也不适用于样逡逑本量有限的病患，例如儿童患者。因此，其他的方法如蔗糖梯度离心法已经被开发出来逡逑以提高外泌体的分离效率。逡逑
例如，Ｔａｎ课题组开发了一种电化学检测癌细胞外泌体的传感器。他们引入了逡逑一种名为ＬＺＨ８的适配体，这种适配体可以特异性地识别ＨｅｐＧ２邋（肝癌细胞）及其外泌逡逑体１８２１。如图１．３所示，适配体ＬＺＨ８与一个ＤＮＡ纳米四面体相连。随后，ＤＮＡ纳米四逡逑面体被同定在金电极表面。固定化的适配体可以特异性地识别并捕获ＨｅｐＧ２外泌体。逡逑在目标外泌体存在的情况下，电极被外泌体覆盖，电化学信号明显下降。该电化学适配逡逑体传感器可实现肿瘤外泌体的高灵敏度检测。逡逑＾逦Ｅｘｏｓｏｍｅｓ逡逑ｍ邋／逦％逡逑Ｓ逦Ｅ邋Ａｐｔａｍｅｒ逡逑Ｒ逦ＡｆＫ邋ＤＮＡ逡逑ｙ逦ｉ逦ｎａｎｏｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ逡逑＇、逡逑４邋Ｓ逦８邋ｐ逦Ｓ逡逑（ｂ）Ｐ逦（Ｃ）邋１－＾．＾．ｒｏａ．逡逑？邋？邋？逦—－邋Ｍａ＊邋ｍｐｕｒｎｍｎ逡逑Ｉ逦ｔ邋！八土逡逑ＩＩＩ逡逑ｆｔ逦？＞逦Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋（Ｖ）逡逑图１．３电化学检测外泌体的Ｉ）ＮＡ纳米四面体传感器。逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ邋ｗｉｔｈ邋ｅｘｐａｎｄｅｄ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｕｓｉｎｇ邋ＤＮＡ邋ｎａｎｏｔｅｔｒａｈｅｄｒａ邋ｆｏｒ邋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．逡逑２０１７年，Ｓｔｕａｒｔ邋Ｉ）．邋Ｉｂｓｅｎ等人＿开发了一种利用交流电动（Ａ（’ｌ＿：）微阼列芯片装界逡逑从血浆中快速分离和检测外泌体的方法，如阁１．４所l:。ＡＣ１：芯片；Ｖ＂超过１０００个电逡逑极，屯极灰呢Q眯亩嗫姿慑危瑁恚柝蚰
本文编号：2819937
【学位单位】：华东理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.1
【部分图文】：
囊泡（ＥＶｓ）有多种类型，从它们的大小和产生机制来说主要包括三类：外泌体（直径逡逑小于１５０ｎｍ）、微泡或脱落颗粒以及凋亡体，后两者直径都大于ｌＯＯｎｍ，并且直接由质逡逑膜释放。而外泌体的生成过程则不同｜１３１，如图１．１所示首先由细胞膜向内生芽形成逡逑早期内体，然后早期内体转运至多呿泡小体（ＭＶＢ），有的多囊泡小体和溶酶体融合后逡逑会将内容物降解，有的多迤泡小体可以与质膜融合释放小囊泡（外泌体）到细胞外部。逡逑在外泌体生成的后期，ｉｌｌ邋ＲａｂＧＴＰａｓｅｓ２７Ａ和２７Ｂ介导多囊泡小体与质膜融合Ｗ。逡逑Ｃ，Ｔ０Ｓ０１邋＇逡逑ＭＶＢ逡逑！（奋）一⑩，Ｍ，＿逡逑＇ｖ邋逦逦邋＾逦、逡逑‘逦Ｍ邋？ｃ’ｏｙ？逦Ｉｍｍｕｎｏ邋ｒ？ｆｔ？ｌａｔｅ／逡逑……．？？参：ｅＳＱＱＦ＾逡逑ｃｅｌｌ逦响逡逑Ｌ＿逦１——二逡逑图１．１外泌体的组成和分泌。逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ邋ａｎｄ邋ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．逡逑目前，可体外培养的细胞几乎都可以产生外泌体，外泌体的来源广泛，在血液、唾逡逑液、尿液、羊水、腹水、乳汁等众多体液以及细胞培养上清液中都能检测到外泌体。外逡逑泌体的粒径（３０？１５０邋ｎｍ）比较小，在电子显微镜视野下才能观察到外泌体的杯状结构。逡逑由于外泌体是细胞分泌的囊泡
１．２．１超速离心法逡逑离心法是利用细胞、囊泡亚群和蛋白质之间的大小差异进行分离的。差速离心法是逡逑目前外泌体分离的金标准，包括一系列逐步提速的离心步骤［５５］。图１．２给出了超离心的逡逑工作流程示意图［５６］，据统计，在所有外泌体研宄中，超速离心法占５６％。使用标准离心逡逑法（＜２００００ｇ）可以分离大的组分包括细胞、凋亡小体和大的囊泡，而从蛋白混合物中逡逑分离外泌体则需要使用超速离心法ＯｌＯＯＯＯＯｇ）。超高的转速、较长的运行时间（？５ｈ）逡逑以及需要严格的技术培训是其主要缺点［５７１。此外，超速离心法常常导致外泌体回收率（５％逡逑？２５％）较低ｔ％，并且经常与蛋白聚集物一起沉淀下来。此外，这种方法也不适用于样逡逑本量有限的病患，例如儿童患者。因此，其他的方法如蔗糖梯度离心法已经被开发出来逡逑以提高外泌体的分离效率。逡逑
例如，Ｔａｎ课题组开发了一种电化学检测癌细胞外泌体的传感器。他们引入了逡逑一种名为ＬＺＨ８的适配体，这种适配体可以特异性地识别ＨｅｐＧ２邋（肝癌细胞）及其外泌逡逑体１８２１。如图１．３所示，适配体ＬＺＨ８与一个ＤＮＡ纳米四面体相连。随后，ＤＮＡ纳米四逡逑面体被同定在金电极表面。固定化的适配体可以特异性地识别并捕获ＨｅｐＧ２外泌体。逡逑在目标外泌体存在的情况下，电极被外泌体覆盖，电化学信号明显下降。该电化学适配逡逑体传感器可实现肿瘤外泌体的高灵敏度检测。逡逑＾逦Ｅｘｏｓｏｍｅｓ逡逑ｍ邋／逦％逡逑Ｓ逦Ｅ邋Ａｐｔａｍｅｒ逡逑Ｒ逦ＡｆＫ邋ＤＮＡ逡逑ｙ逦ｉ逦ｎａｎｏｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ逡逑＇、逡逑４邋Ｓ逦８邋ｐ逦Ｓ逡逑（ｂ）Ｐ逦（Ｃ）邋１－＾．＾．ｒｏａ．逡逑？邋？邋？逦—－邋Ｍａ＊邋ｍｐｕｒｎｍｎ逡逑Ｉ逦ｔ邋！八土逡逑ＩＩＩ逡逑ｆｔ逦？＞逦Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ邋（Ｖ）逡逑图１．３电化学检测外泌体的Ｉ）ＮＡ纳米四面体传感器。逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ａｐｔａｓｅｎｓｏｒ邋ｗｉｔｈ邋ｅｘｐａｎｄｅｄ邋ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ邋ｕｓｉｎｇ邋ＤＮＡ邋ｎａｎｏｔｅｔｒａｈｅｄｒａ邋ｆｏｒ邋ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ｃａｎｃｅｒｏｕｓ邋ｅｘｏｓｏｍｅｓ．逡逑２０１７年，Ｓｔｕａｒｔ邋Ｉ）．邋Ｉｂｓｅｎ等人＿开发了一种利用交流电动（Ａ（’ｌ＿：）微阼列芯片装界逡逑从血浆中快速分离和检测外泌体的方法，如阁１．４所l:。ＡＣ１：芯片；Ｖ＂超过１０００个电逡逑极，屯极灰呢Q眯亩嗫姿慑危瑁恚柝蚰
本文编号：2819937
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