p38MAPK信号通路介导HO-1表达对LPS攻击大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞模型中线粒体融合蛋白的影响

发布时间：2020-09-17 14:34

　　 脓毒症是由宿主对感染的反应失调引起的一种危机生命的器官功能障碍,每年会影响全世界数百万人且病死率高达25%,已成为引起死亡的十大病因之一~([1,2])。过度的氧化应激及炎性反应被认为是脓毒症所致多器官功能障碍的重要原因,其中肺脏是脓毒症中最易受损的靶器官之一~([3])。而在脓毒症肺损伤所涉及的靶细胞中,肺泡上皮细胞是重要的靶效应细胞,肺泡中性粒细胞(PMN)、肺泡巨噬细胞等炎性细胞会粘附于肺泡上皮细胞表面并释放大量活性氧(ROS)以及其他炎性介质使肺泡上皮细胞受损,从而破坏肺内机械屏障,导致大量炎性因子涌入,进而加重肺损伤~([4,5])。线粒体是细胞内重要的细胞器,除了能够产生ATP外,还在细胞程序性死亡的调控、免疫炎性反应、钙信号传递以及脂肪酸氧化中发挥重要作用~([6])。同时,线粒体作为一种动态的细胞器,能通过线粒体动力学作用改变其在细胞内的大小、形状、位置和功能,氧自由基作用在线粒体会致使线粒体融合减少,影响线粒体功能,进而会损害细胞的长期生存能力~([7])。在哺乳动物中,调节线粒体融合的蛋白包括线粒体融合蛋白1(mitofusin,Mfn1)、线粒体融合蛋白2(mitofusin,Mfn2)和视神经萎缩蛋白1(optic atrophy protein 1,OPA1),其中Mfn1、2是定位于线粒体外膜的蛋白而OPA1定位于线粒体内膜~([8])。研究表明,在培养的细胞和小鼠组织中,融合蛋白的缺失会导致线粒体网络严重断裂,线粒体与线粒体之间的物质交换被终止,线粒体DNA含量显著下降,Mfn1和Mfn2功能的丧失导致线粒体代谢功能改变、膜电位丧失并降低线粒体呼吸功能,敲除OPA1会使线粒体膜电位广泛丧失并减少基础呼吸速率~([8,9])。血红素加氧酶-1(HO-1)是一种由ROS和细胞因子诱导的应激反应酶,能够催化血红素降解为一氧化碳、胆绿素和游离铁,在抑制和调节机体组织器官炎症、氧化应激、凋亡和增殖过程中发挥着重要作用~([10])。我们前期的研究表明,在LPS攻击大鼠模型中,HO-1上调可促进线粒体融合,但其机制尚不明确~([11,12])。p38MAPK作为丝裂原活化蛋白激酶亚族之一是信息转导的纽带,可以被细胞外的炎性刺激等因素激活,激活后的p38MAPK通路可调动机体内源性抗炎能力,诱导细胞HO-1表达,调节细胞衰老、凋亡、细胞炎症及其氧化应激,在减轻急性肺损伤的炎性反应中发挥着重要的作用~([13,14])。目前尚无p38MAPK介导HO-1表达对LPS攻击大鼠肺泡II型上皮细胞中线粒体融合影响的相关报道。目的探讨p38分裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)介导血红素加氧酶1(HO-1)表达对脂多糖(LPS)攻击大鼠肺泡II型上皮细胞中线粒体融合的作用。方法将大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞以1x10~6个/ml密度接种于6孔板。采用随机数字表法分为7组:空白对照组(C组)、LPS攻击模型组(L组)、LPS+CO释放剂CORM-2组(LC组)、LPS+p38MAPK抑制剂SB203580组(LS组)、LPS+DMSO组(LD组)、CORM-2组(CO组)和SB203580组(S组)。C组正常培养细胞;L组给予10μg/ml LPS;LC组于加入LPS前30 min给予CORM-2100μM;LS组和LD组于加入LPS前1 h分别给予SB203580 10μM和0.1%DMSO 100μM;CO组、S组分别加入CORM-2 100μM、SB203580 10μM。细胞孵育24 h后,采用MTT法检测细胞活力、硫代巴比妥酸法测定培养液丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、黄嘌呤氧化酶法测定培养液(Superoxide Dismutase,SOD)活性,采用ELISA法测定细胞上清液肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)的水平,采用Western blot法测定p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)、磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38MAPK)、血红素加氧酶-1(HO-1)、线粒体融合蛋白1(Mfn1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)和视神经萎缩蛋白1(OPA1)的表达水平。结果与C组、CO组、S组相比,其余各组MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,细胞活力降低,p-p38和HO-1表达上调,Mfn1、Mfn2、OPA1表达下调(P0.05);与L组相比,LC组MDA含量降低,SOD活性升高,TNF-α、IL-6水平降低,细胞活力升高,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2和OPA1表达上调(P0.05),而LS组MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,细胞活力降低,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1表达下调(P0.05);与LC组相比,LS组MDA含量升高,SOD活性降低,TNF-α、IL-6水平升高,细胞活力降低,p-p38、HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1表达下调(P0.05)。且C组、CO组、S组间,L组和LD组间上述各指标比较差异无统计学意义(P0.05),各组间总p38蛋白表达水平差异无统计学意义(P0.05)。结论HO-1可促进LPS攻击大鼠肺泡II型上皮细胞中线粒体融合,其机制可能与p38MAPK信号通路有关。
【学位单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

天津医科大学硕士学位论文冰乙酸 12.6ml、硼酸 7.5g 混合溶解，并加水定容至 1000ml 置于室温保存。（16） 配制电转液缓冲液：取 Tris 碱 3.035g、甘氨酸 14.4g、200ml 甲醇放入烧杯中，倒入去离子水添加至 1000ml，充分搅拌溶解。1.5 实验方法如下图所示流程处理以 LPS、CORM-2、SB203580 和 DMSO 处理 RLE-6TN细胞，各组处理结束后，继续孵育细胞 24h，采用 MTT 法检测各组细胞活力，并取各组上清液测定炎症因子（TNF- 和 IL-6）及氧化应激指标（MDA 含量和SOD 活性），随后通过 westernblot 检测各组细胞中 HO-1、Mfn1、Mfn2、OPA1、p38 以及 p-p38 的表达水平。

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本文编号：2820841