基于核酸分子检测的肉类源性成分快速鉴别技术的开发与应用

发布时间：2020-09-17 10:41

　　目的:2013年5月8日,国务院总理李克强在国务院常务会议中特别提出“严厉打击肉类产品掺假售假等违法违规行为”。从2013年1月欧洲马肉事件到近期报道的鼠肉冒充羊肉串和狐狸肉冒充牛羊肉等等,“掺假肉”不停地冲击着肉品市场,带来了巨大的负面影响。其中最值得关注的是掺杂鼠肉、狐狸肉、貉子肉和貂肉。由于在饲养皮毛动物的过程中缺乏严格的检疫程序,其肉源可能携带大量细菌、病毒、寄生虫及过敏源。此外,为了保证皮毛的质量,喂养皮毛动物的饲料中含有大量的重金属、激素、抗菌素以及抗病毒药物等物质,造成此类肉源内有毒有害物质严重超标,食用此类肉源将会对人的健康产生巨大的危害。在监管鼠、狐狸、貉子和貂肉源性成分方面,我国面临的三个困境。第一,虽然我们必须严格遵守我国行政法规和法律依据实施监管,但是目前我国并没有明确的法律规定鼠肉、狐狸肉、貉子肉、貂肉等不得食用。第二,虽然食品监管部门应该对此种肉类掺假问题进行严格监管,但是我国掺杂肉鉴别检测标准存在着较大空白,尤其像鼠、狐、貉和貂这些特殊的肉源成分。目前,我国尚无统一的检测方法和标准,且在现有检测其他肉源性成分的标准体系中也没有可以同时检测多种源性成分的检测方法和标准。第三,由于肉类产品具有流通量大和保质期短等特点,在实验室条件下常用的定量和定性检测方法很难满足实时的、快速的、大批量产品检测的需求,因此亟待开发出高通量、快速、便捷、准确的肉源性成分的快速检测技术及产品。本论文基于国家食品监管的完善和肉品市场的检测需求,结合本实验室的快速核酸识别技术优势,以鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分为研究对象,开展了肉源性成分快速检测技术的研究与应用。方法:1、本研究利用生物信息学技术确定了具有特异性的核酸序列,用以作为检测的基因靶点。2、利用引物设计软件Primer5.0、DNAMAN和Primer Explorer V4,设计了一系列的引物,并对其特异性进行了筛选和验证。3、利用动物血液/细胞/组织DNA提取试剂盒提取靶基因的DNA。4、利用紫外-可见光谱确定DNA含量。5、利用琼脂糖凝胶电泳分析了PCR、MPCR、LAMP、RCA扩增产物和酶切产物。6、利用等温环介导方法筛选扩增引物,并对影响LAMP反应的主要因素进行了单因素考察,确定最佳LAMP反应体系。7、利用滚环复制扩增(RCA)方法对设计的识别探针的特异性和有效性进行筛选。8、利用正交实验方法优化DNAzyme过氧化发光信号放大体系实验条件。结果:1、建立了检测鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分的PCR和多重PCR的方法。通过GeneBlast比对,设计并筛选出了四对鼠、狐狸、貉子、貂特异性引物,获得了分别为285bp、744bp、622bp和395bp的PCR扩增产物。利用DNA基因测序和限制性核酸内切酶验证了PCR扩增产物的特异性。测序结果与GeneBank收录的序列具有高于98%的序列同源性,从而建立了用于检测鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分的四种PCR方法和PCR-RFLP方法。运用上述四对引物和文献报道的用于牛肉源性成分检测的PCR引物和用于羊肉源性成分检测的PCR引物,开发出了检测牛肉中和羊肉中掺杂鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分的2重、3重和4重PCR检测方法。该方法可在一个反应中同时检测多种肉源性成分,实现了高通量快速检测,检出限不低于1%(w/w),可以满足现场检测的要求。2、建立了检测鼠源性成分的新型LAMP方法。通过GeneBlast比对,筛选出鼠的特异性基因片段;针对该片段设计了LAMP引物并进行改进,利用荧光定量检测和荧光目测比色法对扩增产物进行比对检测。通过优化引物特异性、引物比例、引物浓度、模板浓度等反应条件,从4组引物中成功筛选出了1组鼠源性成分的等温扩增引物。在优化的条件下(反应温度为63℃,引物比例为1:2:8摩尔比,模板浓度为2~5ng/μL),该方法的检出限不低于1%(w/w)。采用同样方法,从4组套狐狸源性成分LAMP引物中成功筛选出了1组狐狸源性成分的LAMP引物。在优化的条件下(反应温度为63℃,引物比例为1:3:10摩尔比,模板浓度为2~5ng/μL),该引物出现检测阈值时间仍大于30min,表明LAMP引物结构需要进一步优化。采用同样方法对3组貉子和2组貂,源性成分的LAMP引物进行了筛选。但是,没有获得理想的貉子和貂源性成分的LAMP引物。3、建立了检测鼠肉源性成分的RCA方法。通过GeneBlast分析,确定了鼠的16s核糖体亚基的特异性片段作为靶标片段,并针对该靶标片段设计了RCA锁式探针。以鼠源性成分的S系列锁式探针为基础,对环化连接酶进行了筛选,考察了T4 DNA连接酶、连接时间、锁式探针结构、目标基因片段切割点、靶标片段点突变对RCA扩增效率的影响。此外,本实验还考察了phi29 DNA聚合酶扩增体系和Bst DNA聚合酶扩增体系的检测效率,考察了随机引物长度对RCA扩增效率的影响,并最终确定了该检测体系的最适条件。在此基础上,本实验利用RCA体系筛选了S系列、RC体系和FC体系的鼠肉源性成分识别锁式探针。实验结果表明,所设计的锁式探针具有很高的识别效率,并得到了酶切反应的验证,为鼠肉源性成分的RCA快速鉴别奠定技术平台基础。4、建立了检测狐狸肉源性成分的DNAzyme的方法。通过GeneBlast比对,确定了狐狸12s核糖体亚基上特异性基因片段为靶标片段。针对上述基因片段,设计了3组分别含有与靶标片段互补序列和2个富含G岛结构的识别探针对。通过正交试验,对DNAzyme检测体系进行了优化,确定了该检测体系的最适条件。经过实验验证,该方法目测结果与光谱测定结果一致,可实现裸眼可视化检测。由于该方法不需要特殊仪器设备,操作简便,易于实现推广和现场检测,具有较高的开发价值。结论:本论文针对国家亟待解决的掺假肉食品安全问题,开展了鉴别鼠、貂、狐狸、貉子肉源性成分的实验研究。本论文成功地建立了一系列可以同时检测牛羊肉中貂、狐狸、貉子肉源性成分的PCR和MPCR方法,实现了高通量快速检测;基于LAMP原理对LAMP引物进行结构改造,建立了新型的LAMP方法,极大地降低了反应的非特异性扩增,并首次成功的建立了肉品中鼠源性成分的新型LAMP鉴别方法,该方法快速、高效、灵敏度高,适用于现场检测需求。首次将滚环扩增(RCA)技术和DNAzyme裸眼可视化显色体系应用在肉源性成分鉴别领域中,为肉源性成分快速鉴别提供了可靠的实验基础。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R440;R155.5
【部分图文】：

指数,片段,目的,多重

EIEC、EHEC)的多重 PCR 方法[3]；何海宁等人利用多重 PCR重 PCR 方法，实现了同一 PCR 体系同时扩增牛源性（116bp））和鸭源性（322bp）目的基因片段。Izadpanah[5]等人开发一种测肉和肉制品中猪、骆驼、绵羊、驴、山羊、牛和鸡源性成分步应用于动物饲料的鉴定。Alikord[6]等人采用多重 PCR 扩增对生肉和加工肉制品中的马、驴、猪等反刍动物进行了鉴定。肌钙蛋白 I（TnI）、线粒体核糖体蛋白（MRP）和肌钙蛋白列设计引物，以区分鸡、猪、山羊、牛肉和鸵鸟，单重 PCR 和检测限分别为 0.01 和 20ng。并提供了使用基于 mRNA 的肉类法。Song[8-9]等人应用了 TAQ DNA 聚合酶缓冲液中的拭子提本，替代了 DNA 提取过程，成功地缩短了 PCR 方法的时间。，多重 PCR 技术已经非常成熟，可实现 2-7 重的多目标基因片速、高通量检测的首选检测技术之一。

靶序列,多重PCR,指数,片段

图 2 多重 PCR 目的片段指数扩增环介导的等温信号扩增技术（loop-mediated isothermal amplifi）是 2000 年由日本研究人员 Notomi 博士发明的一种新型的体外等核酸片段的技术[10]。LAMP 技术的核心是针对靶基因 6 个区域的段设计引物和具有链置换活性的 BstDNA 聚合酶的应用。BstDNA反应温度是 60-65℃，此恒温条件下利用可以产生环状结构的A 聚合酶链置换合成的活性，在靶序列两端引物结合处循环不断地结构，使得引物在等温条件下引发新链合成，从而使靶基因高效扩前，LAMP 技术已经成功地应用于临床病原因子的检测、遗传因子质量安全等多个领域。Ihira 等[12]利用琼脂糖电泳法检测 LAMP 扩接检测患者血清中的 HHV-6 DNA。Poon 等[13]利用 LAMP 技术检毒，以看家基因或外源性 RNA 分子作为阳性参照，检测了 H1-H3

示意图,原理,示意图,猪肉

中国医科大学博士学位论文开发出基于 LAMP 原理的检测肉源性成分的方法，并取得了很好的应用效果。Amir Abdulmawjood[19]等人基于线粒体细胞色素b基因建立了LAMP检测方法检测鸵鸟肉成分。该方法是结合了实时荧光检测，可以从肉制品中检测出可达 0.01％的鸵鸟肉，检测时间可在 15 min～20 min 内完成，该 LAMP 方法同时具备良好的特异性和敏感性。杨丽霞[20]等针对猪肉线粒体 DNA COXⅠ基因设计 LMAP引物，通过扩增产物电泳和重点染色法鉴定反应，并采用荧光检测仪实施监控反应过程，结果表明该LAMP方法能有效和特异性地检测出牛羊肉中的猪肉成分。

【参考文献】