酪氨酸酶报告基因用于干细胞移植后心梗模型多模态显像

发布时间：2020-09-23 07:27

　　目的:构建以慢病毒为载体的酪氨酸酶(TYR)报告基因,转染SD大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并筛选混合克隆,探讨TYR报告基因细胞水平的光声成像(photoacoustic imaging,PAI)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、以及正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)的可行性。方法:提取SD大鼠股骨骨髓细胞,采用贴壁培养法纯化骨髓间充质干细胞(MSCS),流式细胞仪鉴定干细胞特异性抗体CD45和CD90,CD31和CD44。构建以慢病毒为载体的TYR报告基因(Lentiviral TYR,LV-TYR)并转染MSCs(MOI=3),嘌呤霉素筛选稳定转染的混合克隆(TYR-MSCs)作为实验组,正常MSCs作为阴性对照组。应用Western Blot(WB)、酶标仪吸光度检测法、黑色素Masson-Fontana染色检测各组细胞目的基因TYR的表达。比较不同组、不同浓度细胞的PAI以及MRI成像结果。制备黑色素特异性探针18F-5-氟-N-(2-(二乙氨基)乙基)吡啶甲酰胺(18F-5-fluoro-N-(2-(Diethylamino)ethyl)picolinamid,18F-5-FPN),对不同组细胞进行细胞摄取和阻断实验。结果:成功提取并纯化SD大鼠MSCs,流式细胞鉴定CD90和CD44阳性,CD45和CD31阴性。LV-TYR成功转染MSCs,嘌呤霉素筛选混合克隆。Western Blot、酶标仪吸光度检测法、黑色素Masson-Fontana染色显示TYR-MSCs能表达目的基因TYR,而MSCs无TYR表达。TYR-MSCs组有明显的PAI信号,加酪氨酸(tyrosine)预处理的TYR-MSCs的PAI信号较未预处理的TYR-MSCs信号强。MRI细胞显像显示加三氯化铁(FeCl3)或Tyrosine预处理的TYR-MSCs显示了较高的T1信号,且信号的强度随细胞浓度的增加而增加。同时加FeCl3和Tyrosine的TYR-MSCs组T1信号最强。加FeCl3的MSCs组T1信号有轻度增加。细胞摄取实验结果表明TYR-MSCs对18F-5-FPN的摄取在60min时最高,细胞摄取值为7.86±0.85%(n=3),阻断实验表明,19F-5-FPN能阻断细胞摄取18F-5-FPN。结论:本研究通过慢病毒为载体转染TYR报告基因至大鼠MSCs并构建稳定转染TYR的MSCs细胞系。通过对TYR-MSCs进行PAI、MRI显像以及核素细胞摄取实验,从体外细胞水平证实转染TYR的MSCs可以进行多模态显像,为干细胞在体示踪提供了理论基础。目的:探索应用TYR单一报告基因进行在体正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)、核磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)、以及光声成像(photoacoustic imaging,PAI)以监测心肌梗死模型干细胞移植的可行性。方法:采用左侧开胸结扎SD大鼠左冠状动脉建立永久性心梗模型,结扎后半小时在心梗区周围注射大鼠携带TYR报告基因的大鼠骨髓间充质干细胞(TYR-MSCs),以相同方法注射未转染的MSCs作为对照组。72 h后处死部分大鼠行心肌细胞HE染色以及心脏TTC染色。当天、第6 d、第13 d、第20 d、第27 d行18F-FDG心肌代谢显像鉴定建模成功率。建模后第1 d、第7 d、第14 d、第21 d、第28 d行18F-5-FPN探针的PET成像、MRI成像以及光声成像活体示踪干细胞。结果:结扎冠脉法建模成功率为70%,HE染色可见心梗区域心肌细胞坏死、水肿、变性、空泡形成、心肌纤维断裂以及淋巴细胞浸润等。正常心肌细胞排列整齐,血管丰富。TTC染色可见梗死区域心肌呈白色,平均梗死面积为38.1%±7.3%(n=3)。18F-FDG心肌代谢显像可见心梗区域有放射性分布缺损。18F-5-FPN PET成像可见干细胞移植区有明显局限放射性分布浓聚,其随时间延长放射性分布轻度减低,第1d至第28d从1.78±0.22%ID/g下降至1.62±0.13%ID/g(n=8),无统计学差异(P0.05)。MRI显像T2*WI序列成像可见干细胞移植区信号减低,心梗区域和周围正常心肌的对比度逐渐增加,第1 d至第28 d对比度从59.18±4.9增加至80.5±8.8(n=8),有统计学差异(P0.05)。光声成像可见干细胞移植区明显光声信号,但是信号值第1 d至第28 d从472.6±48.1下降至283.4±49.2,有统计学差异(P0.05)。结论:TYR报告基因可用于活体PET、MRI和PAI多模态显像以示踪干细胞,在体显像显示移植了TYR-MSCs的大鼠心梗区域在28 d内均有PET、MRI、PAI信号。但MRI信号和PAI信号随时间衰减明显,PET信号衰减不明显。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22;R445.2
【部分图文】：

原理图,催化产物,酪氨酸酶,多模态

图 1：酪氨酸酶的催化反应以及催化产物黑色素用于多模态显像的原理急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是指因持久和严重的心肌缺引起的部分心肌急性坏死，是一类患病率及死亡率均较高的缺血性心脏病。其病理改变主要表现为心肌细胞坏死、凋亡细胞数增加、心肌细胞纤维化、瘢痕形成。随着病变的进展，逐步出现心室重构、心脏扩大、心脏收缩功能减低、最终导致心脏功能衰竭[28]。目前急性心肌梗死常见治疗手段包括药物治疗、经皮冠状动脉介入（PCI）和冠状动脉旁路移植术（GABG），但这些治疗手段只能挽救濒死的心肌，对已死亡的心肌细胞没有治疗作用[29]。目前心肌梗死治疗的主要困难在于心肌细胞再生和血管重建。近年来的研究表明，具有再生潜能的干细胞或祖细胞，尤其是体细胞来源的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）为心肌再生提供了一种可能[30]Takuya Narita[31]的统计表明，在一系列干细胞治疗心力衰竭动物实验成功的基础上，已有 40 余项干细胞治疗心力衰竭的临床实验获得注册。目前已完成的临床实验结果

载体,图谱,DNA连接酶

17图 2：载体 GV341 图谱用DNA连接酶连接载体和TYR基因，将TYR基因克隆到载体中。用热休克法转化感受态大肠杆菌E1Coli DH5α，经嘌呤霉素抗性筛落。接入800 μL溶汤肉菌（LB）培养基中37℃摇床振荡培养24 h，小量提取试剂盒提取质粒。PCR法、酶切法筛选正确的重组质粒，测序鉴定载体构建完全正确

滤过,浓缩液,离心力,病毒

图 3：病毒液滤过收集置于转头上在4000 g离心10~15 min，得到浓缩，取出离心装置，分离过滤杯和滤过液收集杯于1000 g的离心力离心2 min，样品收集杯中的图 4：病毒液浓缩液移至病毒管中，-80 °C长期保持，并进行病检测病毒滴度

【参考文献】