人外周血FMR1基因新型可变剪接变异体的检测及其初步功能研究
发布时间：2020-09-22 19:07
脆性X综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种常见的遗传性智力低下性疾病,其致病基因为脆性X智力障碍1基因(fragile X mental retardation 1 gene,FMR1),编码脆性 X 智力障碍蛋白(fragile X mental retardation protein,FMRP)。FMR1基因由17个外显子和16个内含子组成,其初始转录本存在复杂的可变剪接,不同类型的可变剪接变异体可能编码结构功能各异的FMRP。然而,目前对各种剪接异构体的生理功能仍知之甚少。为了研究人外周血FMR1基因可变剪接表达,本研究采用RT-PCR及T克隆-测序技术检测了 10份正常人外周血白细胞各可变剪接产物类型并统计其表达丰度,结果从505个PCR产物-T载体重组质粒中共鉴定出50种FMR1基因可变剪接产物,其中包括27种未报道过的新型可变剪接产物。FMR1基因可变剪接产物中表达丰度最高的为ISO 17和ISO 7,两者均涉及外显子12的跳跃;其次为ISO1(含有编码区全长序列)和IS013(采用外显子17第二剪接受体位点),其余各类剪接产物出现频率皆不高于5.0%。本研究检测出的新型可变剪接产物分别涉及外显子3、4、11的跳跃,内含子7中30bp、87bp片段及内含子9中46bp、140bp片段的插入,这提示人FMR1基因的可变剪接产物远比已知的要复.杂的多。为了探索新型剪接异构体的剪接机制,本研究通过公认的剪接位点预测服务器Human Splicing Finder对其剪接位点进行了生物信息学分析,结果显示27种新型剪接产物均具备3'剪接受体位点和5'剪接供体位点的剪接信号。为了进一步鉴定本研究中发现的新型剪接产物IS051～IS053所编码的蛋白在正常人外周血中存在与否,本研究采用针对其C端氨基酸序列的特异性抗体,通过免疫印迹技术鉴定人外周血白细胞中该剪接产物的蛋白表达水平,结果显示含来自内含子9的大小为140bp插入片段的新型转录本编码的蛋白在成人外周血中均有可检测的表达。为了探索FMR1基因可变剪接对FMRP结构及功能的影响,本研究通过服务器I-TASSER构建了人FMRP全长蛋白及新型剪接产物IS051-IS053表达的蛋白的结构模型,分别对其部分功能进行了预测,结果显示新型转录本所编码的FMRP截短蛋白在细胞内定位发生了改变。为了进一步研究该新型剪接异构体对相应FMRP生物学功能的影响,本研究运用分子克隆技术构建了含编码区全长序列的全长型真核表达载体和一个含新型可变剪接产物IS051的截短型真核表达载体,拟在293T细胞和N2a细胞进行真核表达和过表达研究。本研究不仅丰富了对FMR1基因可变剪接复杂性和多样性的认识,而且为探讨可变剪接对FMRP功能影响、探索FXS发病机制奠定基础。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R596;R440
【部分图文】：
克隆实验后共挑取５０５个白色菌落，提取质粒后进行测序，结果显示．？在所送的逡逑５０５个重组质粒中，共检测出５０种人外周血基因的可变剪接产物，剪接产物逡逑编号参照文献报道［ｎ，１２１，其中，本研宄发现２７种新型可变剪接异构体，如图１－２逡逑所示，编号ＩＳ０２７－ＩＳ０５３，分别涉及外显子３、４、１１的跳跃和来自内含子７中３０ｂｐ逡逑片段、８７ｂｐ片段及内含子９中４６ｂｐ片段、１４０ｂｐ片段的插入，由图可知大部分新型逡逑剪接产物出现频率均低于０．６％。逡逑由图１邋－２、１邋－３可知人外周血■ＦＭ？／基因可变剪接产物中ＩＳＯ邋１７出现的频率最高，逡逑为２８．５邋％邋（１４４／５０５），涉及外显子１２及外显子１７部分片段（５１ｂｐ）的缺失：其次逡逑为ＩＳ０７，占比率为２１．６％（１０９／５０５），仅发生外显子１２跳跃；再次为ＩＳ０１邋（含尸嫌／逡逑基因编码区全长序列）与ＩＳ０１３邋（采用外显子１７第二剪接受体位点），两者所占比逡逑－１４－逡逑
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本文编号：2824799
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R596;R440
【部分图文】：
克隆实验后共挑取５０５个白色菌落，提取质粒后进行测序，结果显示．？在所送的逡逑５０５个重组质粒中，共检测出５０种人外周血基因的可变剪接产物，剪接产物逡逑编号参照文献报道［ｎ，１２１，其中，本研宄发现２７种新型可变剪接异构体，如图１－２逡逑所示，编号ＩＳ０２７－ＩＳ０５３，分别涉及外显子３、４、１１的跳跃和来自内含子７中３０ｂｐ逡逑片段、８７ｂｐ片段及内含子９中４６ｂｐ片段、１４０ｂｐ片段的插入，由图可知大部分新型逡逑剪接产物出现频率均低于０．６％。逡逑由图１邋－２、１邋－３可知人外周血■ＦＭ？／基因可变剪接产物中ＩＳＯ邋１７出现的频率最高，逡逑为２８．５邋％邋（１４４／５０５），涉及外显子１２及外显子１７部分片段（５１ｂｐ）的缺失：其次逡逑为ＩＳ０７，占比率为２１．６％（１０９／５０５），仅发生外显子１２跳跃；再次为ＩＳ０１邋（含尸嫌／逡逑基因编码区全长序列）与ＩＳ０１３邋（采用外显子１７第二剪接受体位点），两者所占比逡逑－１４－逡逑
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