树突状细胞（DCs）在脓毒症心肌损伤中的作用及分子机制研究

发布时间：2020-09-27 11:56

　　 研究背景脓毒症是机体对感染的反应失调而导致危及生命的器官功能障碍,是急危重症病人最常见的死因之一。多脏器功能衰竭是其主要并发症,其中心肌损伤所致心功能障碍最为常见,发病率高达50%。脓毒症时参与固有免疫反应的炎性细胞包括巨噬细胞、树突状细胞(DC)和NK细胞及适应性免疫细胞T/B淋巴细胞发生激活、凋亡或自噬,从而破坏了机体正常的免疫应答,从而加重脓毒症患者的病情。同时,随着病情发展,往往伴有过度的交感神经系统激活、儿茶酚胺大量释放、心率加快,加重了心脏负荷和氧耗,限制心室舒张时间,导致冠状动脉灌注不足,加重心肌损伤,在后面心功能障碍的发生发展中发挥重要作用。研究目的本文旨在通过研究脓毒症时DC成熟和激活与心肌损伤之间的关系、与交感神经系统过度兴奋之间关系,探讨DC在脓毒症心肌损伤发生发展中的作用,为临床治疗寻找新靶点提供理论依据。研究方法1.脂多糖(LPS)对骨髓源树突状细胞的影响研究选用5只6-8周龄SPF级C57BL6雄性小鼠,取小鼠单个股骨骨髓细胞进行培养,采用流式细胞仪进行细胞表型分析鉴定,纯化后的DC分为两组,一组加25μg/LLPS共培养,另一组不加LPS为对照组,培养24h,收集细胞。采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)检测IL-6、IL-12和TNF-α表达水平,Western Blot 测定 IL-6、TNF-α表达水平。2.树突状细胞在脓毒症心肌损伤中的作用研究选用80只8-12周龄SPF级C57BL6雄性小鼠,随机分为四组即:WT-LPS-sham、WT-LPS-VAG539、WT-sham、WT-VAG539 组。WT-LPS-VAG539组和WT-VAG539组给予DC抑制剂(VAG539;30 mg/kg主要抑制DC CD86和CD11c表达),对照组给予等量生理盐水灌胃,每天2次共2天,随后WT-LPS-sham 组和 WT-LPS-VAG539 组给予 LPS 腹腔注射(10mg/kg),WT-sham组和WT-VAG539组给予生理盐水腹腔注射(10mg/kg),造模时间6h。造模给药后统一饮食及环境温度喂养,每24小时统计每组死亡小鼠数量至14天。采用无创小动物尾动脉套管法测量小鼠尾动脉血压。采用超声心动图仪检测心率(HR)、左室射血分数(EF%)和短轴缩短率(FS%)。流式细胞仪分析造模后24小时小鼠心脏组织中DC的成熟标志物CD86和CD11c。ELISA法检测心脏组织中免疫炎症因子TNF-α、IL-12、IL-6表达水平。免疫组化检测心肌细胞凋亡标志物Bax和Bc1-2。3.交感神经兴奋与树突状细胞活化相互作用在脓毒症心肌损伤中的作用研究选用40只7-8周龄SPF级SD雄性大鼠,随机分为四组,即WT-sham、WT-LPS-sham、WT-LPS-Ate、WT-LPS-VAG539 组。WT-LPS-VAG539 组给予DC抑制剂(VAG539;30mg/kg主要抑制DCCD86和CD11c表达)、对照组给予等量生理盐水灌胃,每天2次共2天,随后脂多糖(LPS)腹腔注射(10mg/kg),造模时间24h,成模后WT-LPS-Ate组给予阿替洛尔(5mg/kg),空白组给予生理盐水腹腔注射(10mg/kg)。采用powerlab系统记录交感神经放电和血流动力学指标,高效液相色谱测定血浆中去甲肾上腺素(NE)含量,免疫组化法检测心肌中TNF-α树突状细胞的含量。研究结果1.LPS对骨髓源树突状细胞的影响研究骨髓来源的DCs用LPS(25μg/ml 处理24小时后,用流式细胞技术检测DC成熟标志物。发现LPS可明显上调CD40,CD80和CD86表达的水平,具有统计学意义(*P0.05),虽然可升高MHCII的表达,但无显著性差异。qPCR和Western blotting检测DC表达的炎性细胞因子发现IL-6、IL-12和TNF-α表达水平升高,具有统计学意义(*P0.05)。2.树突状细胞在脓毒症心肌损伤中的作用研究给予LPS腹腔注射后24小时至14天中,WT-LPS-sham组48h死亡率高达50%,96h死亡率为80%,14d为85%;WT-LPS-VAG539组小鼠48h死亡率为15%,96h为35%,14天为45%,与WT-LPS-sham组相比死亡率显著降低(P0.05)血流动力学方面,WT-LPS-VAG539与WT-VAG539组相比,WT-LPS-sham与WT-sham相比,HR均加快,有统计学意义(*P0.05),WT-LPS-VAG539组HR为704±25次/分,WT-LPS-sham组HR为798±28次/分,VAG539处理组心率显著降低(?)P0.05)。WT-LPS-VAG539与WT-VAG539组相比,WT-LPS-shame与WT-sham相比,MBP均下降,有统计学意义(*P0.05),WT-LPS-VAG539组MBP为68±6mmhg,WT-LPS-shamMBP为42±2mmhg,VAG539处理组MBP升高并具有统计学意义((?)P0.05)。通过超声心动图观察小鼠心功能,发现与WT-sham组相比,LPS诱导组,EF%和FS%明显降低,具有统计学意义(*P0.05);与WT-LPS-sham组相比,WT-LPS-VAG539组有所改善,具有统计学意义(#P0.05)。采用流式细胞仪检测心脏中mDC数目,发现LPS处理前后心肌组织中DC数量增加,WT组由1.8%增至6.5%,WT+VAG539组由1.6%增至3.7%。ELISA法检测心脏组织中的TNF-α、IL-12、IL-6水平,结果显示LPS处理可诱导心脏组织炎症因子表达,与WT-sham组相比,LPS诱导组,TNF-α、IL-12、IL-6水平均升高,具有统计学意义(*P0.05);与WT-LPS-sham组相比,WT-VAG539-LPS 组 TNF-α、IL-12、IL-6 表达下调,具有统计学意义(#P0.05)。免疫组化法检测心肌细胞凋亡情况显示,经LPS诱导的WT-LPS-sham组和WT-LPS-VAG539组与WT-sham组相比,Bax水平升高,Bcl-2水平降低,具有统计学意义(P0.05);WT-LPS-VAG539 与 WT-LPS-sham 比较,Bax 升高 Bcl-2降低的不平衡态有所改善,且存在统计学差异(P0.05)。表明LPS诱导了细胞凋亡,而通过抑制DC细胞,能在一定程度上改善细胞凋亡。3.交感神经兴奋与树突状细胞活化相互作用在脓毒症心肌损伤中的作用研究与WT-sham组相比,经LPS诱导24h的三组大鼠左室舒张末压(LVEDP)增大(P0.05),左室压力最大上升和下降速率(±dp/dtmax)降低(P0.05),心率加快(P0.05)。早期给予阿替洛尔后或DC抑制剂后,上述症状有所改善,与WT-LPS-sham组相比,具有统计学意义(P0.05)。高效液相色谱实验显示,与WT-sham组相比,经LPS诱导24h的三组大鼠血浆中NE水平升高(P0.05)。给予β受体阻滞剂阿替洛尔后,NE水平降低,与WT-LPS-sham组比较,具有显著性差异(P0.05)。WT-LPS-VAG539组与WT-LPS-sham相比,NE水平也显著降低(P0.05)。免疫组化结果显示,经LPS诱导的模型组大鼠心肌TNF-α水平较WT-sham升高(P0.05)。给予DC抑制可明显降低TNF-α浸润(P0.05)。WT-LPS-Ate组心肌细胞TNF-α浸润水平有所降低(P0.05)。WT-LPS-Ate组大鼠心肌细胞CD含量较WT-sham组明显升高(P0.05)。WT-LPS-VAG539组与WT-LPS-sham组相比显著降低(P0.05),WT-LPS-Ate组与WT-LPS-sham组相比,也存在具有统计学意义的降低(P0.05)。交感神经放电研究显示,与WT-sham组比较,经LPS诱导的大鼠肾交感神经放电活动明显增加(P0.05),给予Ate或DC抑制剂后与WT-LPS-sham组相比有所降低,具有统计学意义(P0.05)结论在LPS诱导的脓毒血症中,LPS可促进DC在心脏组织中成熟和聚集,通过激活多种免疫细胞来增加炎症因子表达,导致心肌细胞损伤、功能障碍及凋亡。同时交感神经系统的过度激活促进了 DC介导的炎症反应,DC细胞的激活也促进交感神经系统兴奋,二者相互作用加剧脓毒症时心肌损伤。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R459.7
【部分图文】：

料学假设

逦北京协和医学院博士研宄生学位论文逦逡逑实验结果逡逑１．逦ＬＰＳ处理可诱导ＤＣ成熟。逡逑骨髓来源的ＤＣｓ用ＬＰＳ邋（２５邋ｐｇ／ｍｌ）处理２４小时后，用流式细胞技术检测逡逑ＤＣ成熟标志物。发现ＬＰＳ可明显上调ＣＤ４０，邋ＣＤ８０和ＣＤ８６表达的水平（＊尸＜逡逑０．０５），虽然可升高ＭＨＣＩＩ的表达，但无显著性差异，提示ＬＰＳ可促进ＤＣ成逡逑熟。逡逑ＣＤ４０逦ＣＤ８０逦ＣＤ８６逦ＭＨＣ邋ＩＩ逡逑

°逦？逦２３％逦°逦２８％逦°逦＾逦４２．６％逦°逦１逦＾８．２％逡逑＾逦＃逦会＃逦＾逦、逦ｆ逡逑Ｃｏｎｔｒｏｌ逦会逦会逦会逦会逡逑会？逦１逦备逦会ｎ丨逡逑１０２邋１０３逦１０４邋１０ｆ逦１０２逦１０３逦１０４邋１０５逦１０２邋１０３逦１０４邋１０５逦１０２邋１０３邋１０４邋１０５逡逑0逡逑＾—逡逑Ｑ逦？逦７６％逦°逦１逦８０．４％逦°逦９１．４％逦°逦９１．６％逡逑２逦＾逦ｍ逦－邋ｇ逦－逦ｔ逦＾逦ｔ逡逑ａ逦ｊ＂逦会邋Ｌ邋＾逦＇逦会逡逑１０２邋１０２逦１０４邋１０５逦１０２逦１０３逦１０４邋１０５逦１０２邋１０３逦１０４邋１０５逦１０２邋１０３邋１０４邋１０５逡逑逦？邋ＦＩＴＣ逡逑图１．邋ＬＰＳ处理可诱导ＤＣ成熟标志物的表达。逡逑２．逦ＬＰＳ处理可诱导ＤＣ活化。逡逑骨髓来源的ＤＣｓ用ＬＰＳ邋（２５吨／ｍｌ）处理２４小时后，用ｑＰＣＲ技术检测ＤＣ逡逑表达的炎症因子。发现ＬＰＳ可明显上调ＩＬ－６、ＩＬ－１２和ＴＮＦ－ａ表达的水平提示逡逑ＬＰＳ邋可诱导邋ＤＣ邋激活。＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ＶＳ．邋ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ；邋＊＊Ｐ＜０．０１邋ＶＳ．邋ＷＴ邋ｇｒｏｕｐ。逡逑

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