白细胞介素35在脓毒症所致急性肾损伤中的表达及意义

发布时间：2020-10-09 08:19

　　脓毒症所致急性肾损伤(Acute kidney injury,AKI)是脓毒症最常见的并发症之一,发病机制不完全清楚,临床治疗措施有限,死亡率高。深入探讨脓毒症AKI的发病机制是目前肾脏病及危重病领域的热点问题。它的发病机制除了通常的微循环血流异常,炎症,细胞对损伤的自适应反应和微粒子等。目前认为,免疫炎症反应在脓毒症AKI中起重要作用。调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)在脓毒症时免疫抑制状态中起关键作用,它主要通过细胞接触机制和细胞因子分泌方式起抑制作用,其介导免疫细胞凋亡和免疫麻痹,抑制Treg可改善脓毒症预后。TGF-β与IL-10是Treg分泌的主要的抑制性细胞因子,新发现IL-35具更强抑制作用。它能抑制T细胞增殖和Th17的分化及IL-17的产生,明显降低炎症反应,在多种感染性疾病和自身免疫性疾病中参与炎症的免疫调节。并在肿瘤等疾病中与细胞凋亡有关,是近期免疫研究的新热点。本研究拟从IL-35和免疫状态方面着手,观察脓毒症AKI时死亡率和AKI发生率的关系,明确肾组织的病理改变,探讨炎症因子IL-35的变化规律及其与肾组织损伤的关系,为阐明脓毒症AKI的发生机理提供新的理论依据。一、实验方法1、小鼠脓毒症时AKI发生率与死亡率的关系采用盲肠结扎穿孔诱导脓毒症(cecal ligation and puncture,CLP)急性肾损伤模型。模型复制12次,每次取小鼠20只。调整术中盲肠穿孔个数和大小,致术后24h小鼠死亡率高低不同。术后24h处死小鼠,检测血Cr、BUN、ALT、AST水平。行肾组织PAS染色评估肾组织损伤,行Tunel染色检测肾脏细胞凋亡情况。采用Pearson统计分析小鼠死亡率和术后AKI发生率的相关性。2、IL-35在小鼠脓毒症AKI中的表达变化C57雄性小鼠行盲肠结扎穿孔术诱导脓毒症AKI,脓毒症AKI组包括11只术后24小时诱导出AKI的小鼠,对照组为8只行假手术的小鼠。免疫组化法检测IL-35两个亚基IL12A、EBI3在肾脏局部的表达部位,免疫荧光法分析亚基IL12A、EBI3在肾脏局部是否共表达。RT-PCR法检测IL-35的亚基IL12A、EBI3的mRNA表达水平,ELISA检测肾组织IL-35蛋白水平。采用Pearson统计分析肾脏IL-35水平与血清Cr、BUN、ALT、AST水平的相关性。3、LPS刺激肾小管上皮细胞后IL-35的变化细胞在含10%的胎牛血清的DMEM培养液中,37℃、5%C02培养箱中培养至密度达90%时换用无血清DMED同步化24 h后。分别20ug/ml LPS刺激0 h、4 h、8 h、16 h及24 h收集细胞和培养上清。检测上清液LDH 水平,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测凋亡率,RT-PCR法检测IL-35的亚基IL12A、EBI3的mRNA表达水平。以脂质体 LipofectamineTM 2000 5μl 加 IL-35siRNA8ul、对照 siRNA8ul 转染 HKC,以rIL-35共培养HKC细胞24h后,荧光显微镜观察细胞转染效率。RT-PCR法检测各组细胞亚基EBI3的mRNA表达。然后以20ug/ml LPS刺激各组细胞24 h,细胞分为对照组、HKC + LPS 组、rIL-35 + LPS 组、对照 siRNA + LPS 组、IL-35siRNA + LPS组。同法测定细胞上清LDH水平、细胞存活率、细胞凋亡率的变化。二、结果1、脓毒症AKI病理改变及AKI发生情况PAS染色见脓毒症AKI小鼠肾脏病理改变显示,各段肾小管上皮细胞低平、空泡变性,部分崩解脱落。肾间质水肿,少许炎细胞浸润。TUNEL染色证实,脓毒症AKI小鼠肾小管上皮细胞较多细胞为阳性染色。生化检测AKI时常伴有肝功能ALT、AST明显升高。并且脓毒症后小鼠死亡率越高时,AKI的发生率也越高,Pearson相关分析证实脓毒症AKI发生率与死亡率(r= 0.893,p=0.001)呈显著负相关。2、IL-35可在肾小管上皮细胞表达,与肾功能异常相关免疫组化法检测发现,脓毒症AKI组和对照组肾脏中IL12A、EBI3亚基均在肾小管上皮细胞表达,但肾小球和肾小血管中未见这两个亚基的表达,半定量计数证实脓毒症AKI组IL12A、EBI3水平较对照组明显降低(p0.05)。免疫荧光法检测证明IL12A、EBI3亚基在脓毒症AKI组和对照组动物肾小管上皮细胞共表达,而在肾小球细胞中无表达。同时,脓毒症AKI组肾脏IL12A、EBI3的mRNA表达均较对照组显著降低(p0.05)。肾组织IL-35蛋白水平在脓毒症AKI组为182.39±29.18ng/mgTP,较对照组260.87±69.03 ng/mgTP明显降低(p0.05)。Pearson相关分析证实,肾脏局部IL-35蛋白水平与血清 Cr(r=-0.584,p=0.009)、ALT(r=-0.549,p=0.015)、AST(r=-0.475,p=0.04)水平呈显著相关性,而与血清BUN水平无相关性(r=-0.437,p=0.061)。3、抑制IL-35表达能增加肾小管上皮细胞凋亡率体外试验发现,LPS刺激HKC后,随着刺激时间延长,细胞上清LDH水平升高,凋亡率增加。IL-35mRNA在未受刺激的人肾小管上皮细胞不表达,在LPS刺激后其表达呈现先升高后降低。干预实验发现LPS刺激HKC细胞24小时后,与对照组比较rIL-35组、对照siRNA组、IL-35siRNA组上清LDH水平均明显升高(p0.05)。HKC+ LPS组、rIL-35 + LPS组、对照siRNA + LPS组的细胞凋亡率没有明显差异(p0.05),但是IL-35siRNA + LPS组较其他各组,细胞凋亡率明显升高(p0.05)。三、结论体内和体外实验结果均表明,肾小管上皮细胞可表达炎症因子IL-35。IL-35的mRNA和蛋白水平在脓毒症AKI时较对照组表达水平下降,IL-35与肾功能、肝功能水平呈相关性。抑制IL-35的表达可以加重肾小管上皮细胞凋亡。提示肾小管上皮细胞表达的IL-35可能通过影响肾小管上皮细胞凋亡在脓毒症AKI时起保护作用。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R459.7;R692
【部分图文】：

动物模型,小鼠,脓毒症

、肾功能变化逡逑小鼠肾脏ＣＬＰ术后２４ｈ血清Ｃｒ、ＢＵＮ水平较假手术组明显升高（Ｐ＜邋０．０５），ＡＬＴ、逡逑ＡＳＴ水平也较假手术组明显升高（Ｐ＜０．０５Ｍ图１，表１）。表明脓毒症所致急性肾损伤模逡逑型造模成功，且脓毒症所致急性肾损伤小鼠同时伴有明显的肝功能损伤（图２）。逡逑Ｉ立黎■逡逑图１小鼠行ＣＬＰ术复制ＡＫＩ动物模型逡逑表１小鼠ＣＬＰ术后各组ＳＣｒ、ＢＵＮ、ＡＬＴ水平的变化逡逑Ｓｈａｍ邋（ｎ＝８）逦脓毒症邋ＡＫＩ逡逑（ｎ＝ｌｌ）逡逑Ｃｒ（ｕｍｏｌ／Ｌ）逦１０．５３±２．１８逦３２．３４±１７．３２＊逡逑ＢＵＮ（ｍｍｏｌ／Ｌ）逦８．４５±１．０２逦２５．４８±１５．６１＊逡逑ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）逦３４．０６±１３．２０逦１３２．８０±４８．２０＊逡逑ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）逦１１４．４１±４９．１９逦５２５．６８±３８４．８４＊逡逑Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ土ＳＥＭ邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｓｈａｍ．逡逑１３逡逑

小鼠,脓毒症,动物模型

小鼠肾脏ＣＬＰ术后２４ｈ血清Ｃｒ、ＢＵＮ水平较假手术组明显升高（Ｐ＜邋０．０５），ＡＬＴ、逡逑ＡＳＴ水平也较假手术组明显升高（Ｐ＜０．０５Ｍ图１，表１）。表明脓毒症所致急性肾损伤模逡逑型造模成功，且脓毒症所致急性肾损伤小鼠同时伴有明显的肝功能损伤（图２）。逡逑Ｉ立黎■逡逑图１小鼠行ＣＬＰ术复制ＡＫＩ动物模型逡逑表１小鼠ＣＬＰ术后各组ＳＣｒ、ＢＵＮ、ＡＬＴ水平的变化逡逑Ｓｈａｍ邋（ｎ＝８）逦脓毒症邋ＡＫＩ逡逑（ｎ＝ｌｌ）逡逑Ｃｒ（ｕｍｏｌ／Ｌ）逦１０．５３±２．１８逦３２．３４±１７．３２＊逡逑ＢＵＮ（ｍｍｏｌ／Ｌ）逦８．４５±１．０２逦２５．４８±１５．６１＊逡逑ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）逦３４．０６±１３．２０逦１３２．８０±４８．２０＊逡逑ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）逦１１４．４１±４９．１９逦５２５．６８±３８４．８４＊逡逑Ｄａｔａ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｍｅａｎ土ＳＥＭ邋＊ｐ＜０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋ｓｈａｍ．逡逑１３逡逑

脓毒症,小鼠,上皮细胞,肾小管损伤

者是上皮细胞排列紊乱。并出现明显的基底膜裸露，部分上皮细胞脱落，管腔内见脱逡逑落的细胞及细胞碎片，肾间质水肿，淋巴细胞和单核细胞浸润。（图３）。肾小管损伤逡逑评分见脓毒症ＡＫＩ后评分明显升高（Ｐ＜邋０．０５）。（图４）逡逑Ｗ．逦．邋Ｕ—．＇逦．．．卜——逦＇逦－逡逑ｖ．．．卜．．ｖ＇ｍ邋＜？逦、逦？邋■邋．邋．逦■逡逑■，，．敦．逡逑八，？．．逦…逡逑？Ｖ邋．逦．逦？逦、？逦．．？逦，逡逑．．悐？？、？邋．．．邋＊逦？逦，逡逑，逦Ａ逦Ｂ逡逑＇二－－．ｍ逦■邋／邋？逡逑１４逡逑

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