甘露糖及穿膜肽修饰的基因传递系统用于治疗结肠癌的研究

发布时间：2020-10-09 20:37

　　目的:基因治疗从基因的根源出发,是将治疗型基因药物输送到靶细胞或细胞中特定靶点从而来更改基因表达,以治疗疾病的方法,由于高疗效与低毒副的特点,可成为治疗肿瘤等基因疾病的理想方法。但基因治疗临床受限于安全高效的基因载体。本研究目的在于设计一种安全高效的非病毒载体,搭载核酸药物,构建基因传送系统用于治疗结肠癌,为结肠癌的基因治疗提供新的研究思路。方法:以生物相容性良好的小分子量聚乙烯亚胺(Polyethylenimine 5000,PEI_(5K))为骨架,通过异硫氰酸酯甘露糖苷(MPITC)的异硫氰酸酯基团与小分子量聚乙烯亚胺上的氨基反应,合成Man-PEI_(5K),继而通过Man-PEI_(5K)上的氨基与低分子量鱼精蛋白的巯基进行反应,合成载体材料Man-PEI_(5K) CPP。该载体具有较强的正电荷,可通过静电作用搭载核酸药物,形成基因传递系统Man-PEI_(5K) CPP/pDNA,采用马尔文激光粒度仪测定该系统的粒径及电位,并用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察该传递系统的形态。在基因系统的体外评价部分,首先进行细胞摄取实验和肿瘤球穿透实验考察肿瘤细胞对基因系统的摄取能力和该基因系统的穿透能力;通过细胞增殖抑制实验考察载体材料本身的毒性和对肿瘤细胞的选择性杀伤效果;通过Western Blot技术考察肿瘤细胞上治疗基因的蛋白表达情况;通过细胞转染实验考察该载体的基因转染效果。体内评价部分,建立荷人源结肠癌移植瘤的裸鼠模型,采用体内分布实验考察基因系统在体内的分布情况。通过药效学实验考察系统的抗肿瘤效果,并对基因传递系统的生物安全性作了评价。成果与结论:我们发现甘露糖受体(Mannose receptor,MR)除在巨噬细胞和肝脏部位表达外,在结肠癌细胞系HCT116也高表达,故本文的第二章以生物相容性良好的聚乙烯亚胺5000(Polyethylenimine 5000,PEI_(5K))为骨架,为了提高基因传递系统的靶向性与穿膜能力,我们在基因载体上修饰了甘露糖受体的配体甘露糖和穿膜肽。反应具体为:通过异硫氰酸酯甘露糖苷(α-D-Mannopyranosylphenyl isothiocyanate,MPITC)的异硫氰酸酯基团与PEI_(5K)上的氨基反应,合成Man-PEI_(5K),接着Man-PEI_(5K)上的剩余氨基与低分子量鱼精蛋白(Low Molecular Weight Protamine,LMWP)的巯基进行反应,合成载体材料甘露糖-低分子量聚乙烯亚胺-穿膜肽(Man-PEI_(5K)-CPP)。并通过傅立叶红外光谱和核磁共振氢谱对于该载体材料进行表征。构建质粒DNA,用Man-PEI_(5K)-CPP搭载pDNA,从而成功构建一种新型的甘露糖及穿膜肽修饰的基因传递系统Man-PEI_(5K)-CPP/pDNA。这一系统为带正电荷的均一分散的球形纳米粒。我们以肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)作为模型核酸药物,构建基因传递系统Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL,这一体系可以诱导肿瘤细胞凋亡,但不会诱导正常细胞凋亡。PEI_(25K)是一个常用的非病毒载体,为基因转染的“黄金标准”,然而其载体本身的毒性大,用人源胚胎肾细胞(human embryonic kidney 293T cells,HEK293T)先考察载体材料Man-PEI_(5K)-CPP自身的毒性,发现其自身毒性小于PEI_(25K)。而后以PEI_(25K)/pTRAIL作为阳性对照,通过细胞毒性实验,细胞凋亡实验以及Western Blot检测Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的抗肿瘤效果,发现Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的体外抗肿瘤效果优于PEI_(25K)/pTRAIL。采用YoYo-1标记质粒DNA,通过细胞摄取和体外肿瘤球穿透实验考察该基因传递系统的靶向和穿透效果。从上述实验的结果发现Man-PEI_(5K)-CPP/pEGFP的转染,摄取,肿瘤球穿透效果均优于PEI_(25K)/pEGFP。采用增强绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)作为报告基因,发现双修饰系统的转染效率最高。尽管体外实验PEI_(25K)的转染效率高,但其体内效果却差强人意。因此对于体外转染效果良好的基因传递系统的相应体内评价十分重要。本文建立了荷人源结肠癌移植瘤裸鼠模型,考察了Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL的体内分布情况和药效,并对其体内毒性进行了评价。体内分布实验结果表明,Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL在体内的循环时间和靶向肿瘤部位的效果优于PEI_(25K)/pTRAIL。药效实验结果表明,Man-PEI_(5K)-CPP/pTRAIL具有良好的体内抑瘤效果,且体内毒性较小。综上,我们构建的Man-PEI_(5K)-CPP/pDNA具有良好的抑瘤效果,能为为结肠癌治疗提供了一个新思路。
【学位单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.35;R450
【部分图文】：

基因治疗,临床试验

1.1 基因治疗的概述1.1.1 基因治疗的概念及发展1968 年基因治疗的概念首次被提出，基因治疗是从基因根源着手，将治疗基因安全有效地输送至靶细胞，抵消或纠正故障基因对机体造成的不良影响，以治疗疾病[18]。广义上讲，如反义核酸技术[19]和 DNA 疫苗[20]等与分子生物学相关的方法也可视为基因治疗。1989 年美国批准了世界首个关于基因治疗的临床方案[18]。1990 年世界上第一个真正意义上的基因治疗的临床试验展开[21]。2000 年，法国巴黎内克尔儿童医院开展了 X 染色体相关联的重症联合免疫缺陷病的基因治疗临床试验[22]。而目前我国已有 3 项基因治疗新药方案经我国国家食品药品监管局（SFDA）批准进入临床试验阶段[23]。据 Wiley 统计，截止至 2017 年 4 月临床基因治疗的病例中，用于治疗癌症相关疾病占比 64.6%（见图 1.1）[24]。

基因载体,基因治疗,临床试验

声波介导）、化学方法（通过人工合成的化学物质如脂质体和阳离子聚合物介）和生物方法（以病毒载体如慢病毒和腺病毒导入 DNA）。其中，化学方法和物方法实现成功的基因治疗都依赖于高效的基因传输载体来搭载基因药物，所获得合适的基因载体，是基因治疗的关键。1.1.3 基因载体的分类基因载体，是基因药物的运输工具，是它的搭载体系。主要分为病毒类载体非病毒类载体[26, 27]。在基因递送过程中，如果没有载体的保护，裸 DNA 极易降解。所以有效、低毒的基因载体对于基因治疗十分必要。1.1.3.1 病毒类载体病毒类载体转染效率高，截止至 2017 年，约有 67%的基因治疗临床试验均用病毒载体（图 1.2）。病毒类载体分为 DNA 类病毒载体和 RNA 类病毒载体[24]。

非病毒载体,复合物,阳离子脂质体

图 1.3 各种不同结构的非病毒载体与基因的复合物[50]（1）磷酸钙磷酸钙是最早的 DNA 转染材料之一，是一种天然的生物材料，可以与 DNA 混共沉淀成纳米颗粒，且自身具有良好的生物安全性和可降解性[51]。但有观点认为种纳米颗粒会提早释放DNA，使DNA在细胞质内转运困难，不能进入细胞核[52]。且随着转染时间的增加，纳米粒的尺寸也增加，从而导致转染效率不高[53]。（2）阳离子脂质体阳离子脂质体由疏水基团、连接臂、亲水性阳离子头基三部分组成。其中疏水链的长度和转染效率有关[54, 55]，而其连接臂会影响阳离子脂质体的稳定性和生物解性[56]，复合物膜融合的程度受到亲水性阳离子头基的水和程度影响[57]。阳离子质体作为基因载体的优点是其具有类细胞膜特性，在转染时基因的生物学活性不破坏。但阳离子脂质体存在临床试验效率低（在压缩 DNA 方面效率低）和毒性问题。（3）阳离子聚合物[58

【参考文献】