多重靶向性POSS基星型梳状聚合物的制备与表征

发布时间：2020-10-11 09:47

　　 基因治疗在临床应用中遇到了相对严重的瓶颈,即缺乏安全有效的基因传递系统。为了解决这一问题,我们设计了一种低毒高效的基因转染系统,用于转染内皮细胞,以期提高目的基因的递送效率,从而促进内皮细胞的增殖与迁移。1.八氨基笼型倍半硅氧烷POSS-NH_3~+Cl~-在碱性条件下与2-溴异丁基酰溴反应,得到大分子引发剂POSS-(Br)_8,然后通过原子转移自由基聚合(ATRP)依次引发甲基丙烯酸二甲基氨基乙酯(DMAEMA)和聚乙二醇单甲基丙烯酸酯(PEGMA)的聚合,以制备具有生物相容性的POSS核心的八臂星型梳状结构的共聚物POSS-PDMAEMA-PPEGMA。梳状PPEGMA的侧链末端被双键化以便于CAGW或CAG-TAT-NLS功能肽的连接,从而合成具有多功能性的星型共聚物。肽功能化的星型共聚物在水中自组装成纳米粒(NPs),并用绿色荧光蛋白融合质粒pEGFP-ZNF580(pDNA)制备NPs/pDNA复合物。经MTT证实,形成的复合物毒性较低。荧光显微镜和流式细胞仪测试结果显示,这些多靶向功能化的基因复合物能有效转染内皮细胞,其转染效率高于阳性对照PEI 25 kDa。此外,western blot印迹实验、伤口愈合实验和体外血管形成实验也证明复合物可以有效地在内皮细胞中递送和表达pDNA,转染后的细胞具有较高迁移率并且提升了内皮化能力。这些具有梳状结构和POSS核心的星型共聚物是一种具有潜力的基因治疗载体。2.星型梳状聚合物POSS-PDMAEMA-PPEGMA(POSS-DP)与质粒pDNA复合形成二元基因复合物POSS-DP/pDNA,然后多重靶向性的功能肽TAT-NLS或CAG-TAT-NLS与二元基因复合物混合,以形成三元基因递送系统POSS-DP/pDNA/TAT-NLS与POSS-DP/pDNA/CAG-TAT-NLS。相比较于传统的二元基因递送系统,设计的三元基因递送系统具有相对更高的灵活性,便于负载与释放基因。通过细胞摄取实验和体外荧光转染实验结果证明设计的递送系统有利于细胞摄取以及提升内皮细胞的转染效率。
【学位单位】：天津大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R450;O631
【部分图文】：

图 1-1 基因治疗的临床实验所涉及到疾病类型及其分布Figure 1-1 Clinical trials of gene therapy involve disease types and their distribution自那时以来，科学家们尝试从基因水平上探索疾病的治疗方法，并且基因治疗的临床试验逐渐在全球范围获得批准。根据 Wiley 数据库的最新统计情况，截

图 1-2 细胞内基因传递过程。（A）与细胞膜的多重相互作用导致通过巨胞饮作用、吞噬作用和受体介导的内吞作用（小窝和网格蛋白）使复合物内化。（B）早期内涵体的形成（i）；被捕获在内涵体中的复合物在后期内涵体或溶酶体中被消化（ii）并通过胞吐作用从细胞中除去（iii）。（C）（i）通过质子海绵效应诱导复合物从内涵体逃逸，进入细胞质，其中聚合物被细胞质或细胞内的酶逐渐降解（ii）。（D）复合物也可以通过核定位信号肽（NLS）直

我们采用了1H NMR 测试。首先是使用 DMSO-d6作为溶剂，测试了原料八氨基 POSS-NH3+Cl-的结构，如下图2-2 所示。在 0.71 ppm、1.72 ppm 和 2.76 ppm 处可以分别观察到 POSS-NH3+Cl-的特征峰 Si-CH2-CH2-CH2-N（a，b，c，6H），而且三处峰的峰面积接近于 1：1：1。同时可以看到 POSS 的末端氨基（-NH3+，3H）的氢质子在 8.15 ppm 处出现一个强峰。图 2-2 八氨基 POSS 在 DMSO-d6溶剂中的氢核磁图Figure 2-21H NMR of the POSS-NH3+Cl-in DMSO-d6在碱性条件下用 BIBB 溶液酰胺化八氨基 POSS 以合成八臂引发剂POSS-(Br)8，并且其1H NMR 谱图如下图 2-3 所示。 POSS 链的特征峰Si-CH2-CH2-CH2-N（a，b
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