γδT17细胞在肠道急性移植物抗宿主病中的作用及机制研究

发布时间：2020-10-13 19:18

【摘要】：急性移植物抗宿主病(acute graft versus host disease,aGVHD)目前仍然为异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)后最严重、富有挑战性的并发症之一,allo-HSCT后aGVHD发病率约为40-60%,主要累及皮肤、胃肠道及肝脏。其中,肠道aGVHD目前风险高且仍较难治愈,成为allo-HSCT后死亡的重要原因之一,然而,受限于取材困难、区域性关注度少等因素,aGVHD发生发展过程中肠道区域免疫细胞的动态变化及相互作用仍不明确。本研究中我们建立了成熟稳定的小鼠异基因骨髓移植及aGVHD模型,利用肠道黏膜单细胞分离技术,检测了移植后aGVHD小鼠肠道黏膜固有层中T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞、髓系来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cell,MDSC)、树突状细胞(dendritic cell,DC)、固有免疫细胞(innate lymphoid cells,ILC)等数量变化规律及其与aGVHD关系;分析肠道黏膜屏障中重要细胞因子IL-17A、IL-22的变化及其分泌细胞,发现分泌IL-17的γδT(γδT17)细胞为肠道黏膜固有层IL-17A及IL-22的主要来源;利用单细胞qPCR技术对骨髓移植小鼠肠道黏膜γδT17细胞生物学特性进行鉴定,筛选出γδT17细胞在肠道中发挥其免疫调节功能的可能作用机制;最后,本研究建立体外诱导IL-22+γδT17细胞培养体系,发现肠道γδT17细胞为aGVHD中发挥肠道保护作用的关键细胞亚群,并对其调控作用及相关机制进行深入探讨。本研究对于揭示aGVHD中肠道区域免疫特性、发现潜在预防新策略及治疗新靶点具有重要的理论和实际意义。第1章骨髓移植后小鼠肠道细胞亚群研究目的:目前aGVHD发生发展过程中肠道黏膜固有层各种免疫细胞组成、来源及变化尚无较为全面的报道。本部分就骨髓移植后小鼠肠道黏膜固有层细胞亚群进行研究,探索无aGVHD及aGVHD小鼠T细胞、B细胞、NK细胞、MDSC、巨噬细胞、DC等常见免疫细胞来源及其变化规律。方法:我们以Balb/c背景小鼠为受者,以C57/B6背景小鼠为供者建立稳定的小鼠骨髓移植aGVHD模型;于移植后第二周从无aGVHD组小鼠及aGVHD组小鼠中随机选取小鼠,取其肠道观察其损伤状态,利用胶原酶、EDTA、DNA酶等混合而成的消化液将肠道黏膜分离为单个细胞,并利用不同浓度的percoll液将细胞过滤。随后利用流式细胞术检测细胞种类、数量及来源等生物学特性。结果:建立稳定的小鼠骨髓移植aGVHD模型后,我们观察到小鼠体重下降、弓背、腹泻及头面部、背部脱毛等aGVHD症状。解剖后发现小肠肠腔变细,肠壁红色且较薄,肠腔内多处深色稀水样大便残留等。肠道黏膜固有层CD3+T细胞、CD19+B细胞、NK细胞、MDSC、巨噬细胞、DC大部分均表达供者小鼠C57/B6特异性蛋白H2kb。进一步发现,无aGVHD小鼠肠道黏膜固有层B细胞数量相对最多,其次为NK细胞、MDSC、DC、T细胞、巨噬细胞;而aGVHD小鼠T细胞数量相对最多,其次为NK细胞、MDSC、巨噬细胞、B细胞。同一种细胞进行两组比较分析,aGVHD小鼠T细胞多于无aGVHD小鼠,而B细胞、NK细胞、MDSC及DC少于无aGVHD小鼠,巨噬细胞在两组中无显著性差异。结论:骨髓移植后小鼠肠道黏膜固有层免疫细胞大部分为供者来源,aGVHD发生时T细胞明显扩增,具有免疫抑制功能的MDSC明显数量受损。第2章骨髄移植后小鼠肠道IL-17、IL-22变化及其分泌细胞研究目的:细胞因子在aGVHD的发生发展过程中起重要作用,其中IL-17与IL-22均为具有复杂作用的重要细胞因子。目前小鼠骨髓移植模型中肠道黏膜IL-17、IL-22分泌来源仍不清楚,因此本章节将对肠道IL-17、IL-22分泌细胞及其数量等相关生物学特性进行研究。方法:建立小鼠异基因骨髓移植模型后,于移植后第二周从无aGVHD组小鼠及aGVHD组小鼠中随机选取小鼠,取肠道黏膜固有层细胞进行多色流式检测,分析统计细胞IL-17与IL-22分泌细胞种类及比例。结果:骨髓移植后小鼠肠道黏膜固有层免疫细胞IL-17分泌能力无显著性差异,aGVHD组小鼠IL-22分泌能力低于无aGVHD组。两组肠道IL-17A、IL-22主要来源于供者γδT细胞,aGVHD组小鼠肠道中γδT17细胞占供者细胞比例显著低于无aGVHD组,aGVHD组IL-22+γδT17细胞也同样低于无aGVHD组。结论:γδT细胞为骨髓移植后肠道黏膜IL-17、IL-22的主要分泌来源,分泌IL-22的γδT17细胞可能是肠道aGVHD中发挥保护作用的关键细胞亚群,但具体作用和机制仍有待进一步研究和阐明。第3章γδT17细胞在肠道aGVHD中的生物学特性及作用机制研究目的:γδT细胞是一类广泛分布于皮肤肠道等黏膜组织的非MHC限制性固有免疫细胞,被称为适应性免疫和固有免疫的桥梁。γδT细胞的不同亚群在aGVHD的病理过程中可能发挥着致病或者保护的不同作用。然而,小鼠aGVHD中肠道γδT17细胞的生物学特性及其与MDSC等免疫细胞及IEC等基质细胞之间的作用机制尚无报道。方法:首先取移植后无aGVHD组及aGVHD组小鼠肠道,将两组小肠进行免疫荧光染色及拍摄。我们进一步取野生型供者C57/B6小鼠、移植后无aGVHD小鼠、aGVHD小鼠肠道单细胞,染色后利用分选CD45+CD3+γδTCR+细胞,分选后的细胞进行单细胞qPCR检测,筛选其表型与功能。利用IL-1β+IL-23联合全反式维甲酸方案诱导脾脏细胞,检测γδT细胞IL-17、IL-22分泌能力,利用最优诱导方案建立aGVHD模型。结果:小肠免疫荧光提示γδTCR与IL-17A在肠道黏膜固有层处存在共定位。单细胞qPCR结果显示移植后小鼠γδT17细胞高表达il17a、il17f、il8、csf2、IL23R,Il17ra、Il17rc、Ocln等基因,IL-22+γδT17 比 IL-22-γδT17 高表达Il23r、Id2、Steap4、Tlr1、ccr9等基因。在aGVHD发生时,γδT17细胞notch2、csf2、il22基因表达均低于无 aGVHD 组。1Ong/ml IL-1 与 1Ong/ml IL-23 与 1μm RA 培养体系 IL-22+γδT17细胞诱导效率最高。IL-22+γδT17细胞升高可减轻aGVHD严重程度及降低aGVHD死亡率。结论:γδT17细胞存在于骨髓移植后小鼠肠道黏膜固有层,IL-22+γδT17细胞可能为肠道中发挥保护作用的关键细胞亚群,其可能通过分泌细胞因子促进肠道上皮修复、支持肠道紧密连接、招募MDSC抑制免疫反应,Il23r、Id2、Steap4、Tlr1、ccr9、notch2可能为参与γδT17细胞IL-22等细胞因子表达调控的调节因子。IL-22+γδT17细胞在aGVHD过程中具有重要的保护作用。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R457.7
【图文】：

小鼠模型,异基因,小鼠

１．４．１建立稳定的小鼠骨髓移植后ａＧＶＨＤ模型??我们以Ｂａｌｂ／ｃ背景小鼠为受者进行Ｘ线清髓性辐照后，以Ｃ５７／Ｂ６背景小鼠??为供者，根据体重随机分组后进行骨髓移植，建立ａＧＶＨＤ模型（图１．１?Ａ），模??型建立后逐渐显现ａＧＶＨＤ相关症状。由于辐照，第二天开始无ａＧＶＨＤ组??（ｎｏｎ－ａＧＶＨＤ）及ａＧＶＨＤ组小鼠均体重下降，１周后由于造血逐渐恢复两组小鼠??体重均有所回升，２周后，无ａＧＶＨＤ小鼠体重稳步回升，而ａＧＶＨＤ组小鼠由于??ａＧＶＨＤ症状逐渐显现而体重进行性下降（图１．１?Ｅ）。造模后２周ａＧＶＨＤ组小鼠??逐渐出现头面部、背部脱毛现象，并且出现弓背及腹泻，因此体型较无ａＧＶＨＤ组??瘦小（图１．１Ｂ）。为观察肠道损伤状态，移植后２周取两组小鼠，从腹部正中线??将其解剖，取回盲部至阑尾中间部分小肠，浸泡于０．９％生理盐水中，无ａＧＶＨＤ??小鼠小肠可观察到肠壁光滑无出血、破溃，肠腔较粗，较少稀水样大便，而ａＧＶＨＤ??小鼠小肠肠腔变细

固有层,黏膜,骨髓移植,细胞

发现肠道黏膜固有层ＣＤ３＋Ｔ细胞超过９０°／。均表达供者小鼠Ｃ５７／Ｂ６特异性蛋白??Ｈ２ｋｂ?（９２．８±１．８％?ｖｓ?９８．０３±１．８％，ｐ＝０．０２４３?），表明移植后２周时两组小鼠肠道黏??膜固有层ＣＤ３＋Ｔ细胞基本全部来自供者。（图１．２）利用相似方法检测ＣＤ１９＋Ｂ??细胞，骨髓移植后无ａＧＶＨＤ小鼠肠道黏膜固有层ＣＤ１９＋Ｂ细胞几乎全部来自供者??（９６．２±０．３％），ａＧＶＨＤ小鼠肠道黏膜固有层ＣＤ１９＋Ｂ细胞大部分来源于供者??（７４．２±３．３°／。，ｐ＝０．０００３?），其比例少于无?ａＧＶＨＤ?组。（图?１?＿３?）根据?ＣＤ５?表达??情况将Ｂ细胞细分为Ｂ１型（ＣＤ５＋ＣＤ１９＋）、Ｂ２型（ＣＤ５ＴＤ１９＋）细胞分析时，??我们发现骨髓移植后无ａＧＶＨＤ小鼠肠道黏膜固有层以Ｂ２细胞（４３．６±１２．１％）为??主，ａＧＶＨＤ小鼠以Ｂ１细胞（８２．３±１０．６％）为主，发生ａＧＶＨＤ时Ｂ１细胞占Ｂ细??胞比例明显多于无?ａＧＶＨＤ?组（８２．３±１０．６％ｖｓ?１５．９±１０．６％，ｐ＝０．００１５?），而?Ｂ２?细??胞在有无３〇￥１１〇两组中无显著性差异（５３．８士１２．３％丫３?４３．６±１２．１％，？＝０．３６３６）。??（图?１＿４）??Ａ?１?Ｂ?．．?１?Ｃ?移植后肠道黏膜Ｔ细胞来源??１〇＊

固有层,骨髓移植,黏膜,细胞