艰难梭菌实验室检测、分子流行病学及毒力差异研究

发布时间：2020-10-13 19:34

　　 目的:研究艰难梭菌感染实验室诊断方法。研究北京市艰难梭菌分子流行病学特征、抗菌药物敏感性及耐药机制。研究北京市主要流行菌株毒力差异。方法:本研究纳入北京协和医院、北京朝阳医院、航天中心医院及煤炭总医院收集的804份粪便标本及348株产毒素艰难梭菌。实验室诊断方面,基于培养方法,评估艰难梭菌鉴定培养基(Chrome ID C.difficile agar,CDIF)对艰难梭菌的分离、鉴定能力,及谷氨酸脱氢酶试验(glutamate dehydrogenase,GDH)的敏感性和特异性;基于产毒素培养的方法,评估艰难梭菌毒素A/B试验(Clostridium diffcile toxins A/B,CDAB)、GeneXpert试验的敏感性和特异性。分子流行病学方面,对348株产毒素艰难梭菌进行多位点序列分型(multilocus sequence typing,MLST)及核糖体分型,以琼脂稀释法检测艰难梭菌对11种抗菌药物的体外敏感性,并检测GyrA、GryB及RpoB的氨基酸变异,研究喹诺酮类、利福平耐药表型与基因型的关系。毒力研究方面,选取代表性菌株,在mRNA、毒素蛋白、细胞毒性实验及动物实验四个层面研究北京市主要流行菌株的毒力差异。结果:实验室诊断方面,CDIF培养基具有快速、操作简便等特点,且可准确鉴定艰难梭菌。GDH试验具有较高的敏感性(100%)和特异性(92.8%),阳性结果表明标本中存在艰难梭菌,但不能确证菌株是否产毒素。CDAB试验直接检测粪便标本中的毒素,敏感性较低(47.5%),特异性较高(96.4%),不推荐单独用于艰难梭菌感染(Clostridium diffcileinfection,CDI)的诊断。GeneXpert 试验可快速检测粪便标本中的毒素基因,具有较高的敏感性(99%)和特异性(89.7%),但成本较高。推荐使用两步法或三步法检测流程诊断CDI。在分子流行病学方面,本研究报道了 3例ST1/RT027型高毒力菌株,其中2例为中国北方的首次报道,第3例引起重度CDI。北京市主要流行的型别为ST81/PU09、ST37/RT017、ST3/RT001和ST54/RT012四种型别。首次发现并命名了 8个MLST型别:ST382、ST383、ST384、ST385、ST410、ST411、ST413 和 ST414。不同医院间流行菌株的分子型别差异较大,北京朝阳医院70%的菌株为ST81/PU09型艰难梭菌。本研究通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(Matrix-AssistedLaser Desorption/Ionization Time of Flight Mass,MALDI-TOF MS)首次发现 2691.43 Da、2704.91 Da、2711.93 Da、3247.27、3290.76 Da 五个特征峰可准确、快速地鉴别 MLST clade 4集群艰难梭菌,该集群主要包括高度耐药的ST81/PU09型和ST37/RT017型菌株。抗菌药物敏感性研究方面,348株艰难梭菌对甲硝唑、万古霉素、美罗培南、哌拉西林-他唑巴坦均敏感,但对克林霉素(93.1%)、红霉素(69.5%)、四环素(42.5%)、环丙沙星(88.8%)、左氧氟沙星(47.4%)和莫西沙星(40.2%)的耐药率较高,对利福平的耐药率为8.3%。不同型别菌株耐药率差异较大,ST81/PU09型和ST37/RT017型菌株耐药率最高,利福平耐药的菌株主要集中于ST37/RT017型。GyrA、GyrB和RpoB变异是喹诺酮类和利福平耐药的主要机制,不同型别菌株携带耐药基因突变类型和比例差异较大,其中ST81/PU09型和ST37/RT017型菌株携带耐药基因突变率最高。在毒力研究方面,ST1/RT027型菌株在毒素蛋白表达量、细胞毒力及动物毒力三个层面表现出最强毒力,其次为ST3/RT001型菌株,而ST54/RT012型、ST37/]RT017型和ST81/PU09型菌株毒力较弱。ST3/RT001型和ST54/RT012型菌株tcdA、tcdC基因相对表达量显著高于ST37/RT017型和ST81/PU09型菌株;ST3/RT001型和ST54/RT012型菌株tcdB基因相对表达量显著低于ST37/RT017型和ST81/PU09型菌株。结论:现有的实验室诊断方法各有特点,推荐国内实验室使用多种方法联合诊断CDI。北京市已出现ST1/RT027型高毒力艰难梭菌,需加强监测,防止该型菌株暴发流行。北京市主要流行的ST81/PU09型和ST37/RT017型艰难梭菌具有高度耐药、低毒力的特点。本研究对提高CDI实验室诊断能力,掌握北京市艰难梭菌分子流行病学特征、耐药性及毒力状况提供重要数据支撑和参考依据。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

１．１．?ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培养基菌落特点的比较??艰难梭菌在ＣＣＦＡ培养基上具有淡黄色、扁平、粗糙、“油煎蛋”样菌落，在ＣＤＩＦ??培养基上的菌落具有黑色、扁平、粗糙、边缘不整的特点，见图１．１。ＣＣＦＡ培养基??培养时间至少４８?ｈ，而ＣＤＩＦ培养基可在２４?ｈ分离鉴定艰难梭菌。??鶴？着丨??图１．１?ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培养基上艰难梭菌菌落特征??注．？艰难梭菌在ＣＣＦＡ培养基上生长４８?ｈ后的菌落（左），艰难梭菌在ＣＤＩＦ培养基上生长２４?ｈ??后的菌落（又）??Ｆｉｇｕｒｅ?１．１?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｙ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?Ｃ．?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ?ｏｎ?ＣＤＩＦ?ａｎｄ?ＣＣＦＡ?ａｇａｒ??Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｃｏｌｏｎｙ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?Ｃ．?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｎ?ＣＣＦＡ?ａｇａｒ?ａｆｔｅｒ?４８?ｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｌｅｆｔ）．?Ｔｈｅ??ｃｏｌｏｎｙ?ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ?ｏｆ?Ｃ．?ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｏｎ?ＣＤＩＦ?ａｇａｒ?ａｆｔｅｒ?２４?ｈ?ｃｕｌｔｕｒｅ?（ｒｉｇｈｔ）．??１．２．?ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培养基对艰难梭菌的分离能力??２５５份标本中，共分离出６２株艰难梭菌。ＣＤＩＦ和ＣＣＦＡ培养基各分离出６１??株艰难梭菌，一致率达９９．２％（２３３／２５５）。其中，ＣＤＩＦ培养基上４９份（８０．３％，?４９／６１）??标本为形态单一菌落，ＣＣＦＡ培养基上４７份（７７．０％，４７／６１）标本为形态单一菌落，??二者差异无统计学意义（／＝〇．〇４８９

ｉ?＾?Ｉ?－１００?ｂｐ??图１．２?５重ＰＣＲ扩增产物电泳图??注：１号菌株有／ａ／ｄ、／Ｃ６？、Ｃ（Ａ４、ｃ＜ｉ／５四个基因；２－６、８－１２号菌株有／Ｃｄｉ４、ｔｏ／５基因；７??号菌株不含毒素基因；Ｍ为１００?ｂｐ?ｍａｒｋｅｒ??Ｆｉｇｕｒｅ?１．２?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?５－ｐｌｅｘ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｎｏｔｅ：?Ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒ?１?ｓｔｒａｉｎ?ｃｏｎｔａｉｎｓ?ｔｃｄＡ，?ｔｃｄＢ，?ｃｄｔＡ?ａｎｄ?ｃｄｔＢ?ｇｅｎｅｓ．?Ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒ?２－６?ａｎｄ?８－１２?ｓｔｒａｉｎｓ??ｃｏｎｔａｉｎ?ｔｃｄＡ?ａｎｄ?ｔｃｄＢ?ｇｅｎｅｓ．?Ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒ?７?ｓｔｒａｉｎ?ｈａｓ?ｎｏ?ｔｏｘｉｎ?ｇｅｎｅ．?Ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?１００?ｂｐ?ｍａｒｋｅｒ．??２．２．２．基因缺失的判定??ａ－ｅ、ｈ－ｋ菌株条带为１２００?ｂｐ，无缺失；ｆ、ｇ菌株条带为７００?ｂｐ，有??缺失，如图?１．３。??２０００?ｂｐ?－?■?；?Ｌ?＂?＾?丨丨?．［ｊ??１０００?ｂｐ?－?＾Ｈｒ?興??７５０?ｂｐ?－??ｂｐ?－??２５０?ｂｐ?－?■?１?ｉｊ??图１．３?基因ＰＣＲ扩增产物电泳图??注：Ｍ为２Ｋｍａｒｋｅｒ，ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ无於缺失；ｆ、ｇ有缺失；ｍ为阴性对照??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｎｏｔｅ：?Ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?２Ｋ?ｍａｒｋｅｒ．?Ｓｔｒａｉｎｓ?ａ

２５０?ｂｐ?－?■?１?ｉｊ??图１．３?基因ＰＣＲ扩增产物电泳图??注：Ｍ为２Ｋｍａｒｋｅｒ，ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｈ、ｉ、ｊ、ｋ无於缺失；ｆ、ｇ有缺失；ｍ为阴性对照??Ｆｉｇｕｒｅ?１．３?Ｔｈｅ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ＰＣＲ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ??Ｎｏｔｅ：?Ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?２Ｋ?ｍａｒｋｅｒ．?Ｓｔｒａｉｎｓ?ａ，?ｂ，?ｃ，?ｄ，?ｅ，?ｈ，?ｉ，?ｊ，?ｋ?ｈａｖｅ?ｎｏ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ｄｅｌｅｔｉｏｎ．?Ｓｔｒａｉｎｓ?ｆ?ａｎｄ?ｇ??ｈａｖｅ?ｔｃｄＡ?ｇｅｎｅ?ｄｅｌｅｔｉｏｎ，?ｍ?ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??２０??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 程敬伟;徐志鹏;孙林英;侯欣;徐英春;赵玉沛;;难辨梭菌鉴定培养基临床应用评估[J];临床检验杂志;2015年07期

本文编号：2839615