基于滚环扩增和CRISPR辅助PCR的核酸检测新技术研究

发布时间：2020-10-21 09:56

　　 本研究一共探讨了四种检测核酸的新技术,其中包含两种滚环扩增检测方法和两种PCR检测方法。结合滚环扩增和近红外荧光等技术,开发了两种滚环扩增检测技术。将CRISPR基因编辑应用到PCR技术中,从而发展了两种CRISPR辅助PCR检测技术。1.NM-NIRF-spRCA核酸检测技术通过静电吸附和紫外交联,带正电荷的尼龙膜(Nylon membrane,NM)可以简单方便地固定核酸分子。因此,它是一种常用于核酸检测的固相载体。滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)是广泛用于核酸检测的等温DNA扩增技术。近红外荧光(Near infrared fluorescence,NIRF)是一种新的荧光技术,具有背景低、信噪比高、灵敏度高等优点。本章将NM、RCA和NIRF等材料及技术相结合,开发了一种在尼龙膜上检测核酸的简单方法,命名为基于近红外荧光的尼龙膜固相滚环扩增技术(NM-NIRF-spRCA)。该方法只需要两种核酸分子:滚环(RC)和3′末端带有RCA引物的靶特异性探针(-PP)。检测程序由四个步骤组成:(ⅰ)通过紫外交联将靶核酸固定在NM上;(ⅱ)RC和NM上固定的靶核酸与特异性探针杂交;(ⅲ)进行含有Biotin-dUTP的RCA扩增;(ⅳ)用NIRF标记的链霉亲和素温育NM并用NIRF成像仪成像。通过检测寡核苷酸、质粒中的各种HPV亚型的L1片段和大肠杆菌基因组DNA,充分验证了该方法。因此该研究为检测核酸分子提供了一种新的简便方法。2.SLP-RCA核酸检测技术本章介绍了一种使用茎环引物(Stem-loop primer,SLP)进行滚环扩增的新技术。该技术能够在固相和液相中通过线性或超分支滚环扩增(SLP-1RCA或SLP-HRCA)检测靶DNA。对于固相检测,SLP-HRCA分四步检测核酸:(ⅰ)将各种捕获探针(Capture probe,CP)共价结合在固相载体上形成CP阵列;(ⅱ)将CP阵列与DNA样品杂交;(ⅲ)用含有SLP1、SLP2和Biotin-dUTP的反应液在CP阵列上进行RCA反应;(ⅳ)将CP阵列成像。在液相中,SLP-HRCA检测核酸只需一步:进行包含DNA样品、SLP1和SLP2的实时RCA反应。液相和固相检测都采用通用的滚环模板、SLP2和特异于靶DNA的SLP1。在液相和固相上通过检测寡核苷酸和六种不同的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV),初步验证了该技术。还在宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)和临床样品中检测到了两种高危型HPV(HPV16和HPV18),这充分验证了该技术的可行性。本研究为RCA核酸检测提供了新的途径。3.Cas9/sgRNA辅助反向PCR核酸检测技术本章开发了一种基于Cas9核酸酶检测靶DNA的新方法,该方法被命名为CARP(Cas9/sgRNA-assistant reverse PCR)即Cas9/sgRNA辅助反向PCR。该技术可以简单、快捷、特异和灵敏地检测靶DNA。该技术分三步来检测靶DNA:(ⅰ)Cas9与一对特异的sgRNA结合后切割靶DNA;(ⅱ)用DNA连接酶连接切割产物;(ⅲ)用PCR扩增靶DNA。在连接步骤中,Cas9切割的靶DNA可以在分子内连接成环状或在分子间连接成线形DNA。最后用一对反向引物通过PCR扩增连接产物。通过在9种不同人乳头状瘤病毒(HPV)亚型中检测HPV16和HPV18 L1基因验证了该技术。该技术还在两个HPV阳性宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)的基因组DNA中检测到了两个高危型HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV阴性宫颈癌细胞C-33a中没有检测到这两个基因。通过这些概念验证,本研究提供了一种新的基于CRISPR的DNA检测和分型的方法。特别是本研究验证的CARP方法已进行了HPV临床检测,成功地检测了一批临床样品。4.CRISPR分型PCR核酸检测技术本章发展了一种利用CRISPR技术检测目标DNA的新方法,即CRISPR或Cas9/sgRNA分型PCR(CRISPR-or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR)。该技术检测目标DNA只需一步反应:用荧光定量PCR(qPCR)扩增检测Cas9/sgRNA切割后的DNA样品。直接在qPCR反应程序之前额外加一段恒温孵育时间,使Cas9/sgRNA切割反应合并到qPCR反应中。这样就可以用仅仅2个小时的时间来均相检测目标DNA。在整个检测过程中无需打开检测管,ctPCR的全部检测过程可以通过常用的核酸检测设备(荧光定量PCR仪)在较短的时间内完成。通过检测十种不同的人乳头瘤病毒(HPV)亚型的L1基因验证了该技术。该技术在两种HPV阳性宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)中成功地检测了两种高危HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV阴性的宫颈癌细胞中没有检测到HPV的L1和E6-E7基因。最后,通过检测临床样品中的HPV进一步验证了ctPCR方法。因此,本研究提供了一种基于CRISPR的检测和分型DNA的新方法。
【学位单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R440
【部分图文】：

东南大学博士学位论文产物上杂交一段寡核苷酸形成双链，然后用限制性内切酶消化，随后通过模板介导的酶连反应生成许多新的环形 DNA。可以使用这些新环作为模板，用第二组引物进行下一步扩增[20]。Komiyama 和他的同事用切克酶将线性 RCA 产物切割成多种引物进行下一步扩增[21]。

图 1-2 IRDye 800CW 的激发波长和吸收波长。400–800 nm 波段，水（蓝线）、肌红蛋白（绿线）和氧合肌红蛋白（红线）的荧光光谱，以及 Li-Cor Biosciences 公司两种近红外荧光染料（IRDye680 与 IRDye 800CW）的最大发射波长。（图片改编自 http://www.licor.com/）本实验室有一台 Odyssey 近红外双色荧光成像系统（LI-COR，美国），该系统在传统红外激光器的基础上，开发了双色荧光双通道检测技术，增强了荧光信号的检出能力。这项技术充分发挥了近红外荧光的巨大优势，在检测中消除了可见光光谱内的自发荧光。所以该系统背景荧光低、信噪比高。在微孔板[96, 109]、玻璃基片[29]和尼龙膜[109]等固相载体上检测核酸分子时，使用近红外荧光技术能够有效地降低背景从而极大地提高检测灵敏度。我们实验室已经将近红外荧光成像系统用于检测蛋白质、甲基化、微生物和转录因子表达调控等[96, 109-112]，在此基础上，我们结合滚环扩增技术发展了更为简单灵敏的核酸检测方法。1.3 PCR 扩增技术1985 年，Kary Mullis 发明了一种以 DNA 片段为模板，可以得到数百万份拷贝的方法，即聚合酶链式反应（PCR）。该过程改革了许多生物科学和医学的 DNA 检测方式。他在 1993

东南大学博士学位论文指（Zinc finger，ZF）核酸酶转录因子[125, 126]，来自黄单胞菌的 TALE（Transcription activator-likeeffectors）[127-130]，以及最近来自 II 型细菌适应性免疫系统 CRISPR（Clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats）的 RNA 引导的 DNA 内切核酸酶 Cas9[131, 132]。
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本文编号：2849973