目的评估负性共刺激分子可溶性程序性死亡蛋白1(soluble programmed death-1,sPD-1)和可溶性程序性死亡配体1(soluble programmed death-ligand 1,sPD-L1)在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)患者腹水中的表达水平,并探讨其临床意义;通过检测HCC患者血清中的sPD-1、sPD-L1表达水平,探索其与腹水中表达水平的相关性;分析人肝癌细胞株体外培养液中的sPD-L1表达水平,探讨sPD-L1的可能来源;为进一步研究HCC行介入途径抗PD-L1治疗提供实验基础和理论依据。材料与方法1.标本来源:选择40例并发腹水的HCC患者作为实验组,所有病例均有病理或符合临床诊断标准确诊为HCC,参照《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》,将实验组分为两个亚组:早期HCC组(临床分期I、II期)15例、进展期HCC组(临床分期III、IV期)25例;选取20例并发腹水的慢性乙型肝炎肝硬化患者作为对照组;体外培养三种人肝癌细胞株:SMMC7721、HepG2及Huh-7,获取培养液,作为人肝癌细胞株组,设置不含人肝癌细胞株的空白培养液,作为空白对照组。2.获取标本:分别获取实验组及对照组腹水和外周血血清,其中,实验组腹水40例,外周血血清40例;对照组腹水20例,外周血血清20例。获取上述三种人肝癌细胞株培养液上清液,共计3例。3.标本检测:采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测临床标本中sPD-1、sPD-L1含量及培养液中sPD-L1含量。4.数据整理:观察并记录患者年龄、性别、肝脏手术史等一般情况;记录留取标本当天或前后三天内的血常规、肝功能指标、肿瘤指标、血凝指标等;记录Child-Pugh评分分级和临床分期、BCLC分期、ECOG评分;根据实验组患者留取标本前后一月内的增强CT或MRI,评估病灶大小、范围、数量、门静脉侵犯、远处转移等情况。5.统计学分析:应用SPSS 24.0统计软件进行数据分析,计量数据以均数±标准差((x|-)±s)表示,采用t检验或Mann-Whitney U检验进行比较,计数资料采用率(%)表示,采用卡方检验进行比较。变量之间的相关性采用Pearson相关分析或Spearman相关分析;采用受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC curve)评估腹水中sPD-1、sPD-L1表达水平在诊断HCC中的敏感度及特异度。以P0.05为差异有统计学意义。结果1.临床结果实验组患者男性31例,女性9例,年龄为39-74(60.03±10.64)岁;临床分期I、II期15例,III、IV期25例;BCLC分期为A期6例,B期12例,C期22例;Child-Pugh分级为A级17例,B级17例,C级6例;基线病灶直径为(5.57±3.08)cm。对照组患者男性12例,女性8例,年龄42-82岁(61.75±12.20岁),Child-Pugh分级为A级0例,B级11例,C级9例。2.标本检测结果2.1腹水中sPD-1、sPD-L1表达水平腹水sPD-1、sPD-L1浓度值实验组分别为0.3895±0.1103(ng/ml)、0.7599±0.3538(ng/ml);对照组分别为0.3491±0.0786(ng/ml)、0.3521±0.2008(ng/ml)。实验组腹水sPD-1、sPD-L1浓度值均显著高于对照组,差异具有统计学意义(均P0.05)。2.2血清中sPD-1、sPD-L1表达水平外周血血清中sPD-1、sPD-L1浓度值实验组分别为0.4408±0.1158(ng/ml)、0.9067±0.23206(ng/ml);对照组分别为0.3688±0.0480(ng/ml)、0.7525±0.0888(ng/ml)。实验组血清中sPD-1、sPD-L1浓度值显著高于对照组,差异具有统计学意义(均P0.05)。2.3人肝细胞肝癌细胞株体外培养液中sPD-L1表达水平SMMC7721、HepG2及Huh-7培养液中sPD-L1的浓度值分别为0.2890(ng/ml)、0.3753(ng/ml)、0.4257(ng/ml)。空白对照样本中sPD-L1测得浓度值为0.1563(ng/ml)。人肝细胞肝癌细胞株体外培养液中sPD-L1表达水平较空白对照样本显著升高,差异有统计学意义(均P0.05)。3.实验组临床分期亚组分析早期HCC组患者sPD-1、sPD-L1表达水平在腹水中分别为0.3367±0.0221(ng/ml)、0.5902±0.1152(ng/ml),血清中分别为0.3768±0.0549(ng/ml)、0.8023±0.2037(ng/ml);进展期HCC组sPD-1、sPD-L1表达水平在腹水中分别为0.4153±0.0884(ng/ml)、0.8362±0.4149(ng/ml),血清中分别为0.4780±0.1301(ng/ml)、0.9596±0.2261(ng/ml)。进展期HCC组患者腹水及血清中sPD-1、sPD-L1表达水平均显著高于早期HCC组,差异具有统计学意义(均P0.05)。4.HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表达水平与一般资料之间的相关性HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表达水平与BCLC分期、Child-Pugh分级、门静脉侵犯、远处转移、临床分期等指标具有不同程度的正相关(均P0.05)。与年龄、性别、外科手术史、ECOG评分、基线病灶直径、肿瘤范围、肿瘤直径等指标无显著相关性(均P0.05)。5.HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表达水平与实验室检验指标之间的相关性HCC患者腹水中sPD-1表达水平与PLR、WBC、APTT、AST、ALT、AFP、PIVKA-II、PT、PT-INR水平均呈显著正相关(均P0.05),与ALB、PAB水平呈显著负相关(均P0.05);sPD-L1表达水平与NLR、PT-INR、PT、APTT、PIVKA-II、AST、ALT、AFP水平均呈显著正相关(均P0.05);sPD-1、sPD-L1表达水平与LY、NE、RBC、PLT、T-BIL、AST/ALT、γ-GT、ALP、GLB、ALB/GLB、CRP、TT等指标水平无显著相关性(均P0.05)。6.HCC患者腹水及血清中sPD-1、sPD-L1表达水平之间的相关性HCC患者腹水中sPD-1/sPD-L1表达水平同血清中sPD-1/sPD-L1表达水平具有显著正相关(均P0.05);腹水/血清中sPD-L1表达水平同sPD-1表达水平具有显著正相关(均P0.05)。7.受试者工作特征曲线腹水中sPD-1对应的曲线下面积为0.694(P=0.015),95%置信区间(95%confidence interval,95%CI)为(0.539-0.848),诊断HCC的最佳临界值为0.3140(ng/ml),对应的敏感度为80.0%,特异度为55.0%。腹水中sPD-L1对应的曲线下面积为0.841(P0.001),95%CI为(0.740-0.943),诊断HCC的最佳临界值为0.5538(ng/ml),此时的敏感度为77.5%,特异度为85.0%。结论初步研究显示:1.sPD-1、sPD-L1在HCC患者腹水、外周血中高表达;2.sPD-L1在人肝细胞肝癌细胞株体外培养液中阳性表达,提示肝癌细胞可能是sPD-L1的重要来源;3.进展期HCC患者腹水及血清中sPD-1、sPD-L1表达水平显著高于早期HCC患者;4.HCC患者腹水中sPD-1、sPD-L1表达水平与BCLC分期、Child-Pugh分级、门静脉侵犯等临床指标及部分血常规炎症指标、肝功能指标、血凝指标、肿瘤指标具有相关性,表明其在评估肿瘤侵袭性、肝功能受损、机体炎症状态等方面具有一定的临床价值;5.腹水中sPD-1/sPD-L1表达水平同血清中sPD-1/sPD-L1表达水平呈正相关;腹水/血清中sPD-L1的表达水平与sPD-1表达水平呈正相关;6.腹水中sPD-1、sPD-L1检测在HCC筛查诊断中具有潜在临床应用价值。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R735.7;R445.2
【部分图文】：
负性共刺激分子 sPD-1、sPD-L1 在肝细胞肝癌患者腹水中的表达及临床意义 材料与方法⑼显色：加入稀释好的底物 TMB，100μl/孔，室温避光孵育 20min 左右；⑽终止反应：加入终止液 50μl/孔；⑾读板：终止 10min 内，用分光光度计在波长 450nm 处读取 OD 值；⑿计算：以标准品 sPD-1（或 sPD-L1）的浓度为横坐标，对应的 OD450nm 值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算检测标本中 sPD-1（或 sPD-L1）浓度。
著正相关（r=0.386,P<0.014）。（见图 5）7.受试者工作特征曲线根据检测数据分别绘制出腹水中 sPD-1、sPD-L1 表达水平相对应的 ROC 曲线（见图 7）。腹水中 sPD-1 对应的曲线下面积为 0.694（P=0.015），95%置信区间（95%confidence interval,95% CI）为（0.539-0.848），约登指数最大值为 0.350，腹水中 sPD-1诊断 HCC 的最佳临界值为 0.3140（ng/ml），对应的敏感度为 80.0%，特异度为 55.0%阳性似然比（positive likelihood ratio, +LR）为1.78，阴性似然比（negative likelihood ratio－LR）为 0.36（见表 5）。腹水中 sPD-L1 对应的曲线下面积为 0.841（P<0.001），95%CI 为（0.740-0.943），约登指数最大值为 0.625，腹水中 sPD-L1 诊断 HCC 的最佳临界值为 0.5538（ng/ml），此时的敏感度为 77.5%，特异度为 85.0%。+LR 为 5.17，－LR 为 0.26（见表 6）。
标本中sPD-1、sPD-L1表达水平箱图（A:腹水sPD-1；B:腹水sPD-L1；C:血清sPD-1；D:血清sPD-L1）
【参考文献】
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2850221
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