功能化树状大分子在基因转染中的应用及其免疫系统安全性研究

发布时间：2020-10-24 18:36

　　 基因治疗已成为治疗癌症的研究热点之一,主要用于预防及治疗恶性肿瘤,它具有良好的精准度和特异性,而且相对于其他治疗方式副作用较小,安全性更高。基因治疗的高效性主要体现在基因载体的基因转移能力。基因载体可以将目的基因运输到靶细胞内,在细胞内释放出目的基因从而发挥基因的特定效应。非病毒载体作为常用的基因载体,具有安全性高,转移的DNA大小不受限制,免疫原性低等优点,比病毒载体更利于基因传递。树状大分子具有高支化的球形结构,内含空腔且有单分散性、较好的稳定性、溶解性,是理想的基因传递载体。树状大分子表面修饰聚乙二醇(PEG)可降低细胞毒性、免疫原性,提高基因传递效率。此外,其表面修饰叶酸(FA)后具有体内外靶向性。本课题的主要研究内容是第五代树状大分子(G5.NH2)经修饰后作为非病毒基因载体进行基因传递。研究对象是Au DENPsm PEG(P1)和Au DENPs-PEG-FA(P2)。首先针对这两种载体材料进行理化特性的表征,主要有核磁分析、紫外分光光度计测定以及透射电子显微镜观察。再经过琼脂糖凝胶电泳技术测定载体完全压缩质粒DNA的能力以确定适宜的氮磷比浓度。粒径大小和电势正负的测量初步研究载体与质粒DNA形成的复合物能否顺利地进入He La细胞。载体压缩质粒DNA后可以采用绿色荧光蛋白表达检测和荧光素酶的表达试验来研究载体携带质粒DNA的基因转染能力。为了确定细胞吞噬载体材料的效率,运用激光共聚焦显微镜和流式细胞术来检测其内吞效率及细胞内定位。实验结果表明:在N/P为1:1,2.5:1和5:1时,载体P2的基因转染和细胞吞噬效率比P1显著提高。载体和质粒DNA复合体的大小适中,电位在正常范围内,从而有利于进行基因转染和细胞吞噬。同时,载体在浓度很高时细胞活力仍能达到75%以上,表明载体的细胞毒性小,生物相容性好。FA修饰的载体P2在N/P为0.5时就可以完全压缩质粒DNA,同时在N/P为2.5时,此载体的基因转染效率比没有修饰FA的载体材料的基因转染效率高很多,说明此载体P2不仅可以高效压缩质粒DNA,而且较未修饰FA的对照材料,其基因转染效率和基因传递效率大幅提升,生物相容性也有了一定改善。更重要的是在免疫安全性方面,经反转录实时定量荧光聚合酶链式反应试验对细胞因子表达量检测结果表明,载体和载体与质粒DNA复合物进入巨噬细胞中,不会引起强烈的免疫应答反应,表现出低免疫原性。相比较而言,载体和Cp G DNA复合物进入细胞会引起强烈的免疫应答反应,说明载体负载Cp G DNA后并没有消除Cp G DNA的高免疫原性。总之,载体不仅具有高效的基因转染效率,而且细胞毒性和免疫原性均很低,该载体作为高效的基因转染载体,在生物医学上的应用具有良好的发展潜力。
【学位单位】：东华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R450
【部分图文】：

物载体可以应用于基因传递和药物运输，但他阳离子聚合物载体，成为理想的基因传简介是一类高度分支化的单分子聚合物，其形状均能够调节[18,19]。它是由一个多官能核心，整体形成一个大的空腔[20,21]。其中特定通道如图 1-1）。此外，分子结构均一性高，具有性，球形结构表面有大量的外围基团，可特殊结构适合运载药物分子，也可用于基因树状大分子也可以用于某些抗癌药物运输，负载所需疏水药物，另一种途径是在主要方与水溶性药物进行共价连接，其药物传递系入体内。

图 1-2 Th1 型细胞免疫应答和 Th2 型体液免疫应答一般来说，机体的免疫应答可以划分为 Th1 型细胞免疫应疫应答两种（如图 1-2），Th1 型免疫应答过程中分泌细胞因子活巨噬细胞，诱发 IV 型变态反应；Th2 型免疫应答分泌细胞 IL-10，诱发产生特异性抗体。免疫应答作用应用于消灭肿瘤十分重要的作用。CD8+杀伤性 T 细胞可以用于攻击肿瘤细胞肿瘤细胞的效果。CTL 攻击肿瘤细胞过程中，分为三个阶段（抗原识别阶段，T 淋巴细胞表面受体特异性识别肿瘤抗原，T原呈递细胞表面的抗原肽-主要组织相容性复合物特异性结合给 CTL 细胞识别。然后是 T 细胞被活化、T 细胞增殖与分化识别后迅速被活化，从而表达出大量的不同类型细胞因子及相胞会逐渐增殖分化成具有肿瘤特异性的 T 细胞。最后是效应阶段，效应 CTL 细胞识别肿瘤靶细胞，经活化释放胞内颗粒细胞的细胞膜穿孔，释放颗粒酶促进靶细胞凋亡[62,63]。除此之经活化后，跨膜蛋白 FasL 高度表达，然后启动凋亡信号的转

种（如图 1-2），Th1 型免疫应答过程中分泌细胞因子 IFN-γ、IL胞，诱发 IV 型变态反应；Th2 型免疫应答分泌细胞因子 IL-诱发产生特异性抗体。免疫应答作用应用于消灭肿瘤细胞的过的作用。CD8+杀伤性 T 细胞可以用于攻击肿瘤细胞，达到识的效果。CTL 攻击肿瘤细胞过程中，分为三个阶段（如图 1-3阶段，T 淋巴细胞表面受体特异性识别肿瘤抗原，T 细胞抗原胞表面的抗原肽-主要组织相容性复合物特异性结合形成复合细胞识别。然后是 T 细胞被活化、T 细胞增殖与分化阶段，T速被活化，从而表达出大量的不同类型细胞因子及相应的受体增殖分化成具有肿瘤特异性的 T 细胞。最后是效应 T 细胞产应 CTL 细胞识别肿瘤靶细胞，经活化释放胞内颗粒，释放穿胞膜穿孔，释放颗粒酶促进靶细胞凋亡[62,63]。除此之外，效应，跨膜蛋白 FasL 高度表达，然后启动凋亡信号的转导进而引瘤小鼠体内输入被肿瘤抗原激活的 T 细胞，可引起荷瘤小鼠产答，这是抗肿瘤治疗的有效手段之一。
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本文编号：2854838