第一部分激光响应型靶向相变分子探针的制备及性能检测目的制备一种激光响应型靶向相变分子探针(HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP),检测其基本的物理化学性质、体外液气相变及光热性能。细胞实验观察HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的光热效应及特异靶向HER2阳性乳腺癌细胞的能力。方法采用双乳化法联合碳二亚胺法制备HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探针,并检测其表面形貌、粒径与电位、紫外吸收光谱、SPIO装载量等理化性质。免疫荧光法及流式细胞术检测HER2抗体(Herceptin)与分子探针连接率。检测DIR-SPIO-PLGA/PFP分子探针在近红外(NIR)激光激发下的液气相变能力及光热能力。CCK-8法检测不同浓度的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和Herceptin对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SKBR3的杀伤作用。NIR激光辐照下,检测不同浓度HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP对乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SKBR3的光热治疗效果。激光共聚焦显微镜观察靶向分子探针特异与HER2阳性人乳腺癌细胞株SKBR3细胞结合的能力。结果通过双乳化法联合碳二亚胺法制备的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探针为棕褐色乳液,扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM)、透射电镜(Transmission electron microscope,TEM)显示该靶向分子探针为壳核结构的纳米球。马尔文粒径仪检测DIR-SPIO-PLGA/PFP和HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的平均粒径分别为278±83.29 nm和298±109.5 nm,平均电位分别为-1.78±3.57mV和-2.61±3.53 mV。紫外吸收光谱显示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在764 nm处有吸收峰。电感耦合等离子体发射光谱(ICP-OES)测量SPIO包封率为93%。流式细胞术测得Herceptin与分子探针连接率为99%,BCA蛋白浓度定量测得其连接量为0.28 mg/mL。4℃条件下放置7天,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP粒径均无明显变化,反映出良好的稳定性。在NIR激光触发下,DIR-SPIO-PLGA/PFP可发生液气相变,形成微泡。体外光热实验显示DIR-SPIO-PLGA/PFP具有较高的光热效率,具备用于光热治疗的潜能。HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和游离的Herceptin对乳腺癌MDA-MB-231细胞均无明显的细胞毒性。而HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP和游离的Herceptin随着浓度增加对SKBR3细胞显示出一定的细胞毒性。给予激光辐照后,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP对SKBR3细胞显示出随浓度提高而增大的细胞毒性,而对MDA-MB-231细胞无明显杀伤作用。体外靶向实验显示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可特异聚集在人乳腺癌SKBR3细胞膜(HER2阳性)周围,而较少聚集在人乳腺癌MDA-MB-231(HER2阴性)细胞膜周围,进一步证实HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP具有特异靶向HER2阳性细胞的能力。结论通过双乳化法联合碳二亚胺法成功地制备了HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP靶向分子探针。该分子探针大小均一、分散性好,SPIO及Herceptin装载量高,稳定性好。同时具备激光响应性液气相变的能力。细胞实验证实其靶向HER2阳性乳腺癌细胞效率高,在NIR激光辐照下可有效杀灭SKBR3细胞,有望成为用于HER2阳性乳腺癌诊疗一体化理想的分子探针。第二部分激光响应型靶向相变分子探针用于多模态成像研究目的观察DIR-SPIO-PLGA/PFP分子探针体外磁共振成像、光声成像和超声成像效果;采用裸鼠乳腺癌移植瘤模型观察HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在体内进行磁共振、光声、超声及近红外荧光成像的能力及其原理。方法制备体外凝胶模型,应用磁共振扫描仪和光声成像系统对不同浓度的DIR-SPIO-PLGA/PFP分别进行磁共振和光声成像并检测信号强度。NIR激光激发下,采用超声诊断仪研究DIR-SPIO-PLGA/PFP、PLGA/PFP及生理盐水的超声成像效果,并采集灰度信号。建立裸鼠SKBR3乳腺癌移植瘤模型,当肿瘤体积达到200 mm~3时进行体内多模态成像实验。把荷瘤裸鼠随机分为三组,分别经尾静脉注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP、DIR-SPIO-PLGA/PFP和生理盐水,注射前后各时间点分别行磁共振、光声成像,并测量相应的信号强度。在体内超声成像实验中,三组荷瘤鼠在尾静脉给药6小时后行NIR激光辐照肿瘤,采集激光辐照前后的超声图像及信号强度。在体内近红外荧光成像实验中,分别采集随机注射不同分子探针后各时间点荷瘤鼠的荧光图像并测量其信号强度。结果体外磁共振成像和光声成像结果显示,DIR-SPIO-PLGA/PFP随着浓度的增加其磁共振T2*成像和光声成像可明显增强,且1/T2*信号和光声信号均随着DIR-SPIO-PLGA/PFP的浓度提高成线性增强关系。体外超声成像显示,DIR-SPIO-PLGA/PFP在激光触发前呈稍高回声,在激光触发后超声B模式和CEUS模式下回声强度均显著提高。体内乳腺癌成像实验显示,尾静脉注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP后,肿瘤部位磁共振、光声、荧光信号逐渐增强,在6小时达到最高峰。而对照组裸鼠肿瘤部位未见明显的磁共振、光声、荧光信号。体内超声成像结果显示,在给药6小时后激光触发下,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可明显增强B模式和CEUS模式下的超声显影效果,而注射非靶向纳米粒DIR-SPIO-PLGA/PFP和生理盐水的裸鼠其肿瘤部位未见明显增强的超声信号。结论制备的DIR-SPIO-PLGA/PFP在体外凝胶模型显示出多模态显影的潜能。体内乳腺癌移植瘤模型进一步展示了HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP可在HER2阳性乳腺癌肿瘤组织中有效富集并多模态显影,对HER2阳性乳腺癌的诊断有一定的应用前景。第三部分激光响应型靶向相变分子探针治疗HER2阳性乳腺癌的实验研究目的研究HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP联合NIR激光治疗乳腺癌的效果其相关机制。评估HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的生物安全性及体内分布。方法建立SKBR3乳腺癌移植瘤模型,当肿瘤体积长至200 mm~3时,把荷瘤裸鼠随机分成5组:1.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组,2.DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组,3.HER-DIR-PLGA/PFP+NIR组,4.单纯激光组,5.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP组。其中1、2、3、4组,在给药6小时后给予NIR激光辐照(2 W/cm~2,10 min),并用红外热成像仪记录肿瘤部位的升温情况。各组裸鼠均观察21天,每2-3天监测其肿瘤体积和裸鼠体重。各组处理2天后,每组随机处死一只裸鼠采集肿瘤标本行HE、PCNA及TUNEL染色,显微镜观测肿瘤细胞的增殖和凋亡情况。为检测HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP在肿瘤内部渗透距离,将9只荷瘤裸鼠随机分为3组,分别为1.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组,2.HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP组,3.HER-DIR-SPIO-PLGA+NIR组。1、3组在给药6小时后给予NIR激光辐照(2 W/cm~2,10 min),检测各组分子探针在肿瘤部位的渗透距离。为评估HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP的生物安全性,在各组观察21天后,处死各组裸鼠收集主要脏器进行HE染色,观察有无形态结构改变。取健康昆明鼠尾静脉注射HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP(10mg/m L,200mL),并在处理后的各时间点收集血液检测肝肾功能及荧光强度。进一步采用ICP-OES检测各时间点注射分子探针的荷瘤鼠主要脏器中的Fe含量。结果体内治疗结果显示,在激光辐照后,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组肿瘤部位的温度迅速上升至54.1℃,能有效破坏肿瘤细胞。而DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组肿瘤部位温度只上升至47.9℃。HER-DIR-PLGA/PFP+NIR组和生理盐水+NIR组肿瘤部位温度分别为44.2℃和43.9℃。21天后,观察各组荷瘤鼠肿瘤体积,无激光辐照的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP组肿瘤体积增长了2.9倍,肿瘤生长未受到明显的抑制作用。在DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组,HER-DIR-PLGA/PFP+NIR组和生理盐水+NIR组,肿瘤体积分别增长了1.4倍,1.9倍和2.1倍,说明肿瘤生长受到了一定程度的抑制。而只有HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组,荷瘤鼠肿瘤生长被明显抑制。肿瘤组织HE切片显示,HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组肿瘤细胞结构消失,形态不清,细胞发生凝固性坏死。PCNA和TUNEL结果显示该组肿瘤组织的增殖指数较其余几组显著降低,凋亡指数较其余几组显著升高,差异具有统计学意义(*P0.05)。免疫组织荧光显示HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP+NIR组大量血管被毁坏,促进分子探针碎片向肿瘤组织内部渗透。而单纯HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP组,分子探针主要富集在血管周围。HER-DIR-SPIO-PLGA+NIR组显示出中等距离的渗透,说明PFP在激光触发下的爆破效应为促进分子探针向体内扩散的主要途径。观察期内,所用浓度的HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP对裸鼠肝、肾功能无明显影响,各组主要脏器HE染色均未见明显异常,证实该高分子探针良好的生物安全性。且该分子探针在体内的血液循环时间长,主要分布于网状内皮系统。结论HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP联合NIR激光能有效抑制HER2阳性乳腺肿瘤生长,并具有良好的体内生物安全性,为HER2阳性乳腺癌的诊疗一体化提供一种新方式。
【学位单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R737.9;R445
【部分图文】：
图 1-1 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 扫描电镜图Fig.1-1 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP under scanningelectron microscope图 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 透射电镜图Fig.1-2 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP undertransmission electron microscope
图 1-1 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 扫描电镜图Fig.1-1 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP under scanningelectron microscope图 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PFP 透射电镜图Fig.1-2 The morphology ofHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP undertransmission electron microscope
附图R-DIR-SPIO-PLGA/PFP 扫描电镜The morphology of-SPIO-PLGA/PFP under scanningicroscope图 1-2 HER-DIR-SPIO-PLGA/PF图Fig.1-2 The morpholoHER-DIR-SPIO-PLGA/PFP transmission electron microscope
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