集成多模式分离和原位检测的微流控细胞芯片及其应用研究

发布时间：2020-11-04 01:19

　　 细胞检测在重大疾病的预防、诊断以及疗效评估等方面有着十分重要的作用。如今,癌症和脑部神经系统疾病已成为影响人类健康的两大重要疾病。临床上对于人体外周血中的肿瘤细胞的检测和脑脊液中白细胞的检测存在明显不足。微流控芯片具有高通量、样本需求量少、可以高度集成灵活多变的微流体通道和高度兼容性的检测单元的优势,将微流控芯片技术与细胞分离检测相结合,将有利于实现重要细胞的分析检测,为临床上细胞检测提供新方法。本文的主要研究工作及结果如下:(1)设计了集成细胞分离、磁捕获及原位荧光观测于一体的多功能微流控芯片,其包含MOFF分离区和磁富集荧光检测区。针对血细胞-HepG2混悬液样本,通过优化流体流速,在进样流速为50μL·min~(-1)时,可以在芯片MOFF分离区分离除去大量血细胞,减少了其对HepG2细胞富集过程的干扰,并在检测区利用外磁场对免疫磁珠标记的HepG2细胞进行二次富集。采用制备简单、生物相容性好的碳量子点(CQDs)对HepG2细胞进行标记,实现了可视化观测。利用倒置荧光显微镜,采用人工计数的方法对捕获到的微量HepG2细胞进行了定量分析,样本的捕获效率达到88.5%±6.7%(n=20)。本方法集成了细胞的分离富集及荧光观测,通过微流控芯片实现对肿瘤细胞-血细胞样本的分析检测,为CTCs临床快速检测提供基础。(2)设计制作了用于人工脑脊液中白细胞分离富集-原位检测的DEP微流控芯片,自主设计了具有四组阵列式叉指电极、一组抛物线电极的H构型DEP微流控芯片,四组50对并联的叉指金电极,长度m=900μm,宽度为20μm,每对电极之间的间距n=15μm,抛物线电极半径r=750μm,四分之一圆之间间隔t=55μm。搭建了人工脑脊液中白细胞DEP分离富集-原位拉曼/原位荧光检测微系统。针对人工脑脊液中白细胞的分离富集从理论上进行了论证,对自主设计的DEP微流控芯片的分离富集性能进行检测,在激励电压5Vp-p、激励频率4MHz、样本流速50μL·min~(-1)条件下,在自主设计的DEP微流控叉指电极和抛物线电极上,成功对人工脑脊液样本中的白细胞进行了分离富集,经过四组叉指电极初步分离、抛物线电极二步富集后,捕获效率为78.7%(n=3)。(3)基于自主设计的DEP微流控芯片上人工脑脊液中白细胞的分离富集与拉曼光谱仪的结合,采用微波法合成的银溶胶对白细胞拉曼信号进行放大作用,优化了白细胞-银溶胶相互作用时间6h,优化了拉曼检测参数:积分时间10s、检测功率70.2mW,实现了基于DEP微流控芯片的人工脑脊液中白细胞的分离富集-原位拉曼检测,成功获得了477、511 cm~(-1)两个白细胞特征峰,对富集后的白细胞进行了定性检测。(4)采用荧光标记技术,通过荧光试剂DTOC6(3)对人工脑脊液中白细胞的标记,将自主设计的DEP微流控芯片与荧光化学发光微孔板检测仪结合,成功获得了芯片分离富集人工脑脊液中白细胞数量与荧光强度的关系,建立了标准曲线:y=0.0164x-0.0991,R~2=0.9928,并检测出自主设计的微流控芯片抛物线电极处最大检细胞测量为200个。采用实验建立的标准曲线对合成的白细胞-人工脑脊液样本进行检测,将扣除空白组所得的荧光强度值代入实验建立的标准曲线,计算出细胞个数分别约为44.42、95.55、141.17,与三组合成样本所含的细胞数目50、100、150进行比较,准确度分别为88.84%、95.55%、94.11%。与传统临床脑脊液检测相比具有快速、高效多功能的优势,为临床脑脊液中细胞检测提供了新方法。
【学位单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446
【部分图文】：

该离心力可对血液中的 CTCs 进行一步分离。使用癌细胞行最大程度的优化后，在 3 mL h-1的通量的条件下实现了超过率。在第二类中，Sollier 等[27]开发了一种具有多个伸缩储层且平行排列的芯片结构（图 1.1F）。当样品流速具有高雷诺数（分离出大于临界直径的细胞，而小于临界直径的任何细胞则被成功地从乳腺癌和肺癌患者的血液中提取并定量了 CTCs，具有钟分离 7.5 mL 全血），终浓度高（最终体积降至 300μL）的优流体也被用于分离具有不同变形能力的细胞。Hur 等[28]设计了一，利用变形诱导力和惯性升力之间的平衡。与常规乳腺癌细胞（MCF-7 细胞具有较强的转移潜能，尽管两种细胞的直径相 细胞倾向于朝中心线流动。与其他两种分离方法相比，基于惯接触式方法。在分离过程中，细胞悬浮在流体中，不会接触任将细胞损伤降至最低[29]。另一方面，基于惯性的细胞分离中升多个参数影响，包括通道尺寸、横截面纵横比、粒径、流速和[27]。

)基于介电泳场流体分离（DEP-FFF）肿瘤细胞[40]；(B)使用多孔流分离（癌细胞分离的微流体装置示意图[46]；(C)使用光诱导介电泳（ODEP）力分离的微流体装置示意图[50].2 (A) A continuous-flow chamber based on dielectrophoretic field-flow-fractiF) to isolate tumor cells[40];(B) Schematic diagram of a microfluidic device fortion using multi-orifice flow fractionation (MOFF) and DEP[46];(C) An illustraluidic device using an optically induced-dielectrophoretic (ODEP) force for caisolation[50]于磁操控的细胞分离富集法磁操控分离富集细胞，已成为相对成熟和可靠的基于微流体的]。该方法使用磁场梯度来从样品中选择性地分离磁性颗粒标记称为免疫磁性技术。与惯性微流体和 DLD 等被动水动力学方法离主动施加强磁场力来分离富集磁性颗粒标记的靶细胞，减少粒相互作用对细胞分离的影响。因此，这种技术能够实现更高的

过简单的磁筛选便可进行细胞分离。在施加外部在孔边缘，而未标记的血细胞被流动的液体除去现了人全血中 CTC 的分离，回收率高达 90％左接触对于提高分离效率起着至关重要的作用。此成像和分析之后，分离的特殊细胞被释放并收集磁富集需要对样本进行标记前处理的问题，Viov传统免疫磁性分离方法。在标记靶细胞的同时，形成图案的磁阱，动态地组装成微流体通道中的有特定生物标志物的细胞被组装的磁珠捕获。之应用于 CTC 分离。虽然通过该方法避免了样品制这种方法的机制类似于免疫捕获的细胞分离，优使用外部磁场进行可控释放和重建。为了实现样，微流体磁装置需要足够强大的磁吸附力来克服响。
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 莫建华,林斌;微流控芯片光学检测系统集成化新进展[J];光学仪器;2004年06期

相关硕士学位论文 前1条

1 郝敦玲;芯片介电电泳细胞DEP富集过程研究[D];重庆大学;2008年

本文编号：2869385