基于组装方法构建新型高性能基因递送系统

发布时间：2020-11-05 13:47

　　 基因治疗是一种通过编辑细胞内基因或引入外源治病基因,从根本上实现对疾病治疗的方法。然而,这一理念的实现需要突破复杂的组织及细胞屏障将基因递送到细胞中,并在不破坏机体正常功能的条件下表达出治疗分子。此外,普通的化学药物治疗需要足够的血药浓度才能达到治疗目的,相似地,基因治疗的实现也需基因递送到足够多的靶细胞中,以实现治病目的。在过去的近30年时间里,临床基因治疗被用于遗传性疾病、癌症、慢性传染病等的治疗。相当数量的临床Ⅰ/Ⅱ期实验证明了基因治疗方法对于一些危重大疾病包括遗传性血液病、神经及免疫系统相关疾病等具有突出的疗效。鉴于基因治疗实现的药物“核酸”在体内易降解,这些治疗都利用了载体构建出递送系统的技术来实现。有效的基因治疗与低毒、高效的基因载体密不可分。鉴于病毒性基因载体具有免疫原性等诸多缺陷,非病毒性基因载体以势不可挡的姿态进入了科学家的视野。而在不同类型、不同递送原理的非病毒类载体中,研究最为广泛的是阳离子基因载体。以此为基础的递送系统更加多样和安全,但与病毒性载体相比,其效率还有很大的提升空间。目前的基因递送系统研究更多的集中在提高细胞吞噬率这一点,事实上,基因的表达受到诸多因素的影响,包括细胞质内基因的稳定存在,以及内涵体逃逸以后,细胞内基因顺利释放并表达。本论文主要以来源广泛、相容性好、可降解的生物分子为基础,致力于通过组装这一非共价键连接的方式,设计制备出既具有较高的吞噬率、又具有核酸释放促进功能的阳离子聚合物基因药物递送系统。首先,我们选取聚天冬氨酸这一低毒、生物可降解、生物相容性好的聚合物,设计合成了环糊精-苯环主客体组装超分子,用于基因递送系统的研究。我们分别制备了星型、以环糊精为核的基于聚天冬氨酸的聚阳离子,以及带有苯环侧链基团的线型聚天冬氨酸骨架。通过环糊精与苯环的主-客体组装,将星型聚阳离子与线型骨架组装在一起,得到一系列可作为基因治疗递送系统使用的基于聚天冬氨酸的具有生物可降解性的超分子组装体。制备得到的超分子组装体表现出良好的降解性、较高的核酸缩合能力,较低的细胞毒性。更重要的是,在不同的材料(N)/核酸(P)比例下,超分子组装体介导的基因转染效率明显高于其主-客体组装中的主体,即环糊精的星型聚天冬氨酸聚阳离子衍生物。除此之外,通过自杀基因治疗体系进行的体外抗癌实验,也进一步证实了组装体的高效率。这一研究为设计制备可降解超分子药物递送系统提供了新的思路和方法。其次,我们在组装结构设计促进基因转染效率的基础上,尝试引入具有更强电荷竞争力的肝素,进一步促进核酸释放,提高组装递送系统的基因转染效率。肝素,作为一种具有高密度的负电荷的多糖,通过“graft onto”等化学修饰手段,在生物医用材料领域引起了广泛关注。但由于肝素单一的溶解性,极大的限制了其化学改性,进而限制了其应用领域。在本工作中,我们首先报道了一种改性肝素溶解性的方法,即通过引入四丁基铵组分将肝素由水溶性改性成油/水两亲性以用于进一步化学修饰。随后,我们通过原子转移自由基聚合(ATRP)反应合成了一系列肝素为骨架的梳型共聚物,并通过组装形成了包含肝素的凝胶结构型聚合物纳米颗粒。我们测试了这些纳米颗粒的pDNA缩合能力、细胞毒性以及转染能力,并与已报道的基因载体相比较。这些纳米颗粒被证实具有高转染和低毒性,是有效的基因递送系统。证明了将可降解肝素负电性生物分子引入进入基因载体,可以在保证转染效率的同时,有效的降低载体毒性。同时,我们也证实了,通过改性肝素的溶解性,进而对其进行聚合物接枝修饰和功能化以拓宽其应用是可以实现的。我们的研究也为拓宽肝素化学改性方式及应用领域提供了基础。最后,我们基于肝素溶解性的改性手段,设计合成了一种新型低毒性核-壳结构的纳米组装体(Hep@PGEA)。这种组装体带有可解锁的负电性肝素核心(HepNP),通过还原响应解锁,释放后的肝素与外层壳结构中的阳离子聚合物PGEA作用,促进其中缩合的核酸的释放。除此之外,作为一种众所周知的负电性多糖,具有丰富的磺酸基团,除了与阳离子发生较强的相互作用,还具有促进血管生成、抗凝、抗炎等作用,对心血管疾病具有重要意义。Hep@PGEA被证实对miRNA和pDNA都可以实现高效递送,并通过分别递送功能核酸实现了针对心梗这一典型心血管疾病模型的高效基因治疗。同时,我们通过实验证实,随心梗的发展,心脏组织中谷胱甘肽(GSH)含量呈升高趋势,有利于还原解锁Hep@PGEA载体系统中NA的释放。随后,我们提出了分阶段递送的治疗方法,通过Hep@PGEA对miR-499和pVEGF的分阶段递送,实现了在心梗初期时抑制心肌细胞凋亡、降低心脏损伤,随后促进血管再生、恢复心脏血供的分步的体系化治疗。这一分阶段核酸递送在保持和恢复缺血后心脏功能,减小梗死面积、促进血管再生以及抑制心肌细胞肥大方面取得了令人惊喜的结果。除此之外,由于生物还原剂在生物体的广泛存在,我们提出的可解锁肝素组装纳米复合体以及分阶段治疗策略也将为其他危重疾病提供新的方法和思路。综上所述,我们以可降解、生物相容性好的聚天冬氨酸或肝素多糖为基础,结合组装和原子转移自由基聚合的方法,制备出较低毒性、可以促进核酸释放的阳离子聚合物基因载体,实现高效地基因递送和表达,对构建新型多功能基因递送体系具有重要意义,也为肿瘤、心血管疾病的治疗提供了新方法、新思路。
【学位单位】：北京化工大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R450
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 生物分子及其在药物递送中的应用
        1.1.1 聚天冬氨酸
            1.1.1.1 聚天冬氨酸作为靶向分子的载药释放体系
            1.1.1.2 聚天冬氨酸作为载体组分的载药释放体系
        1.1.2 肝素
            1.1.2.1 肝素作为药物的载药释放体系
            1.1.2.2 肝素作为载体组分的载药递送体系
    1.2 基因治疗与阳离子聚合物递送体系
        1.2.1 阳离子聚合物递送体系
        1.2.2 阳离子聚合物在组织工程支架中的应用
        1.2.3 阳离子聚合物在药物递送中的应用
    1.3 原子转移自由基聚合（ATRP）
    1.4 组装（assembly）在功能性生物材料合成中的应用
    1.5 课题的目的及意义
第二章 环糊精-苯环主客体组装基因递送系统
    2.1 前言
    2.2 实验部分
        2.2.1 实验原料与试剂
        2.2.2 实验仪器与设备
        2.2.3 基因载体的合成
2）'>            2.2.3.1 合成氨基修饰的环糊精（CD-NH₂）
            2.2.3.2 线型、星型聚天冬氨酸β-苄酯（PBLA、CD-PBLA）的制备
            2.2.3.3 线型聚天冬氨酸β-苄酯部分羟基化
            2.2.3.4 星型聚天冬氨酸β-苄酯氨基化
            2.2.3.5 CD-PAsp-DET与PAsp-EA-BLA的主-客体组装
        2.2.4 聚合物的表征
        2.2.5 聚合物/pDNA复合物的表征
        2.2.6 细胞毒性
        2.2.7 体外转染实验
        2.2.8 细胞内吞效率检测
        2.2.9 自杀基因转染测试
        2.2.10 统计学分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 基于聚天冬氨酸的载体材料的合成与降解
        2.3.2 聚合物/pDNA复合物的生物物理表征
        2.3.3 细胞毒性
        2.3.4 基因转染实验
        2.3.5 细胞内吞实验
        2.3.6 5-FC/ECD体系体外抑瘤实验
    2.4 小结
第三章 肝素梳型共聚物及其组装基因递送系统
    3.1 前言
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验原料与试剂
        3.2.2 实验仪器与设备
        3.2.3 两亲性肝素（HepTBA）的制备
        3.2.4 制备基于肝素的ATRP大分子引发剂（Hep-Br）
        3.2.5 通过ATRP对肝素进行接枝修饰
        3.2.6 聚合物表征
        3.2.7 聚合物纳米颗粒的表征
        3.2.8 聚合物/pDNA复合物的表征
        3.2.9 体外细胞毒性实验
        3.2.10 体外转染实验
        3.2.11 统计学分析
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 可油溶肝素盐（HepTBA）的制备与表征
        3.3.2 肝素大分子引发剂（Hep-Br）的制备与表征
        3.3.3 通过ATRP将PEGMEMA接枝修饰到肝素上
        3.3.4 通过ATRP将DMAEMA修饰到肝素基聚合物上
        3.3.5 聚合物/pDNA复合物的表征
        3.3.6 细胞毒性实验
        3.3.7 体外基因转染实验
    3.4 小结
第四章 可解锁组装核-壳结构核酸自促释放型基因递送系统
    4.1 前言
    4.2 实验部分
        4.2.1 实验原料与试剂
        4.2.2 实验仪器与设备
        4.2.3 肝素核-壳组装纳米颗粒载体材料的制备及表征
        4.2.4 肝素核-壳组装纳米复合体的基因缩合能力检测
        4.2.5 细胞毒性和吞噬率检测
        4.2.6 miR-499和pVEGF功能核酸的体外基因递送
        4.2.7 miR-499和pVEGF功能核酸的体内基因治疗
        4.2.8 统计学分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 Hep@PGEA纳米组装体的制备与表征
        4.3.2 Hep@PGEA/NA复合体表征
        4.3.3 细胞存活率和细胞吞噬率
        4.3.4 体内聚集实验
        4.3.5 基于miR-499功能核酸的基因治疗
        4.3.6 基于pVEGF功能核酸的基因治疗
        4.3.7 基于miR-499和pVEGF功能核酸的新型分阶段心梗基因治疗
    4.4 小结
第五章 结论
参考文献
致谢
研究成果及发表的学术论文
作者简介
导师简介
附件

【参考文献】

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本文编号：2871719