六种虫媒病毒的多重实时荧光定量PCR方法的建立

发布时间：2020-11-07 20:17

　　 背景及目的:基孔肯雅病毒(chikungunya virus,CHIKV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)、黄热病毒(yellow fever virus,YFV)、日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)是常见的六种虫媒病毒,主要通过蚊虫叮咬的方式在人群中广泛传播,它们在全球分布广泛,感染人数众多,带来严重的疾病负担。它们在感染人体后,会引起发热、皮疹、乏力等类似的临床表现,给临床医生进行疾病的早期鉴别诊断带来一定困难。此外,共感染病例的出现,给临床诊断和治疗带来巨大挑战,极易导致漏诊、误诊。目前,常用的检测方法,由于受到各种因素的影响,不能完全满足临床的需求。因此开发一种新的鉴别诊断方法,对该类疾病的诊断、治疗、预防与控制具有重要意义。近年发展起来的实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR),它具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点,受到人们广泛关注。本研究基于实时荧光定量PCR技术,探索建立一种能同时检测上述六种虫媒病毒的方法,提高检测效率,为临床诊断提供一种新的快速检测方法。方法:从美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中下载CHIKV、DENV、WNV、JEV、ZIKV和YFV基因序列,用MEGA7.0软件进行序列比对分析。针对CHIKV-E3、DENV3'-UTR、WNV-NS2A、YFV5'-UTR、JEV5'-UTR、ZIKV-E基因的保守区域设计引物和探针。利用标准品质粒和病毒RNA模板进行多重实时荧光定量PCR检验,建立标准曲线,并评价各体系的特异性、灵敏度和重复性。结果:设计的引物探针相互之间没有交叉非特异性扩增。检测CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV和ZIKV的检测下限为5拷贝/反应和10-3～10-1TCID50/反应之间。循环阈值(cycle threshold,Ct)与起始模板拷贝数的对数和病毒滴度的对数的相关系数都在0.99以上。用不同稀释梯度的标准品质粒分别进行重复性检测,每个稀释度中Ct值的变异系数均小于4%。对收集到的31份疑似感染虫媒病毒的临床样本用新建立的方法进行检测发现,样本阳性率为87.1%(27/31),与商品化试剂盒的检测结果一致,符合率为100%。这些样本中没有共感染病例的出现。用这种方法去检测样本,最快可在2小时内完成。结论:我们成功地建立了一种能同时检测CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV和ZIKV的实时荧光定量PCR方法,并具有特异性好、灵敏性高、稳定性强、快速、简便等优点。该方法可以用于临床样本检测,有一定的实用价值。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R440
【部分图文】：

体系引物特异性验证结果

图 2.多重荧光定量 PCR 检测方法灵敏度验证（标准品质粒）我们将测定好的 TCID50 的不同病毒统一稀释到 2×104TCID50/ml，然后提取病毒 RNA，再进行 10 倍比等比稀释。利用稀释好的病毒 RNA 对我们建立的多重 qPCR 方法进行灵敏度检测。图 3 展示的是该方法对 CHIKV-RNA、YFV-RNA、JEV-RNA、ZIKV-RNA 的检测结果，我们可以看到各自典型的扩增曲线，且不同稀释度的病毒滴度的对数与 Ct 值之间存在良好的线性关系，其R2值都在 0.99 以上。我们得到了各自的标准曲线曲线方程，往后，我们通过实验检测样本的 Ct 值，代入到方程中，就能估算样本的病毒滴度。通过该实验我们可以发现：针对 CHIKV 的检测下限为 10-2TCID50/反应；针对 YFV-BJ01和 YFV-SH01 的检测下限都为 10-2TCID50/反应；针对 JEV 的检测下限为 10-

30图 3.多重荧光定量 PCR 检测方法灵敏度验证（病毒 RNA）3.4 重复性检测对浓度为 106～100拷贝数/μl 的 CHIKV、DENV、WNV、YFV、JEV、ZIKV 基因重组质粒，分别进行检测，重复 3 次，根据 Ct 值计算平均数、标准差及变异系
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本文编号：2874426