基于核酸扩增技术的蛋白质荧光检测方法研究

发布时间：2020-11-08 17:23

　　 蛋白质是一类重要的生物大分子,是生命功能的主要承担者。当具有某种特定功能的蛋白质发生表达异常或功能异常时,可能导致机体发生病变甚至癌变。蛋白质的表达研究能够揭示细胞的生理或病理状态,揭示药物或环境等因素对细胞的影响,帮助我们深入地了解生理和病理现象,了解疾病的发生、发展和治疗效果。而生物样本中特定蛋白质的检测对于疾病的诊断、治疗和药物筛选等也具有十分重要的意义。具有诊断和治疗意义的蛋白质通常在体液中的含量极低,加上生物体内源性物质的干扰,这就使得这些蛋白质的检测方法必须具有较高的灵敏度和特异性。目前,常用的蛋白质检测方法包括酶联免疫吸附测试(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、电泳法、质谱法、电化学法和荧光法等。其中,荧光法具有灵敏度高、特异性强和操作简单的优势。近年来,以纳米材料扩增技术和核酸扩增技术为基础构建的蛋白质灵敏检测方法为生物样本中蛋白质的分析提供了有利手段。本论文以滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)、杂交链式反应(Hybridization chain reaction,HCR)和催化发夹自组装(Catalytic hairpin assembly,CHA)等扩增策略为基础,选择血小板源生长因子 BB(Platelet-derived growth factor,PDGF-BB)、肿瘤坏死因子 a(Tumor necrosis factor a,TNF-a)、干扰素γ(Interferon γ,IFN-γ)和酪氨酸蛋白激酶7(Tyrosine protein kinase 7,PTK7)为分析模型,构建了用于生物样本中或细胞膜表面蛋白质检测的新型荧光生物传感方法。本论文主要分为六章:第一章为绪论部分,主要概述了蛋白质的功能、检测意义和蛋白质的灵敏检测方法,以及本论文解决的科学问题和主要研究内容。第二章,构建了一个新型“自封闭”适体探针,该探针包含两个功能区域:(1)适体序列,位于探针的3'末端,具有目标物识别的功能;(2)信号转导序列,位于探针的5'末端,具有信号转导的功能。另外,探针的适体序列与信号转导序列可部分杂交,具有“自我封闭”的功能。在相同碱基数目的情况下,分子内杂交较分子间杂交更稳定,因此,该“自封闭”适体探针较己报道的阻滞链封闭的适体探针更稳定,有利于降低探针非特异性折叠产生的背景信号。结合链取代扩增反应(Strand displacement amplification,SDA)和双重指数型滚环扩增反应(Dual exponential rolling circle amplification,DE-RCA),我们构建了一个“自封闭”适体探针介导的级联扩增策略,实现了 PDGF-BB的超灵敏检测,检测限为0.38 fM,线性范围超过6个数量级,优于阻滞链封闭的适体探针介导的相同扩增策略的结果。通过替换探针中的适体序列,本方法还实现了对小分子腺苷的灵敏、特异检测,说明该策略能够拓展用于多种目标物的灵敏分析,在生物检测领域具有较大的应用潜力。第三章,构建了一个DNA发夹结构催化组装驱动的三维DNA walker。该walker以核酸修饰的磁纳米颗粒(Magnetic nanobeads,MNBs)为运行轨道,以单纯的DNA杂交反应为驱动力,能够在核酸或蛋白质的触发下自发进行。与酶驱动的三维DNA walker相比,该催化组装驱动的DNA walker更加简单和通用,通过更换识别元素,可用于核酸和蛋白质等生物分子的分析。以Smallpox gene为核酸分析模型,本方法的检测限达4.1 fM;以PDGF-BB为蛋白分析模型,检测限达2.3 fM,说明该walker体系可用于多种特定目标物的检测,在生物传感领域具有较大的应用价值。第四章,构建了一个基于双条码策略和单分子计数的细胞因子多重检测方法。IFN-γ和TNF-α与一系列生理和病理过程如肺结核、HIV感染和黑色素瘤等密切相关,因此被选为分析模型。本方法中,通过抗体-抗原-磁纳米探针复合物的形成引入一级条码链;通过一级条码链触发的多分枝HCR反应产生二级条码链;通过二级条码链捕获荧光探针,产生荧光;通过分别清点荧光点的数目,对目标物进行定量,实现了 IFN-y和TNF-a的同时、灵敏检测,检测限均为5fM。本方法中的条码策略与经典的条码分析方法不同,无需对条码链进行解离和再固定,避免了条码链的损失和交叉杂交。此外,我们利用该方法对人血浆中的IFN-y和TNF-α进行了同时定量,说明该方法在疾病的早期临床诊断中具有较大的应用潜力。第五章,构建了一个结合诱导的切刻酶位点重构策略,用于活细胞表面膜蛋白的定量分析。本方法中,首先,我们设计了一个含有适体序列、触发序列和切刻酶识别位点的适体探针;没有目标物时,适体探针以发夹结构的形式存在,此时,切刻酶识别位点的两段互补序列相互分离,因而不能被切刻酶识别和切割;有目标物时,适体探针与目标物结合绑定诱导探针发生构象转变,同时使切刻酶识别位点发生重构,触发序列暴露;接着,切刻酶识别该位点并进行切割反应,释放触发序列;最后,游离的触发序列在均相条件下触发级联的RCA和HCR反应,生成一条含有多个G-四倍体结构的多分枝DNA聚合物,实现信号的级联放大。本方法实现了 PTK7的超灵敏检测,检测限为0.3 fM。此外,本也实现了对活细胞表面PTK7的定量分析,并可区分正常细胞和肿瘤细胞以及不同肿瘤细胞之间PTK7的表达差异,说明本方法为活细胞表面膜蛋白的定量检测提供了一个可靠的手段。第六章为结论和展望部分,对本论文的研究成果进行了总结和展望。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.1
【部分图文】：

除了直接富集信号分子，纳米材料也可富集信号转导分子，常用的信号转导??分子是寡核苷酸序列，这是一种将蛋白质检测转化为ＤＮＡ检测的信号扩増模式。??Ｍｉｒｋｉｎ课题组首次提出了蛋白质分析的生物条形码策略５１，如图１－２Ａ，首先，??在ＡｕＮＰｓ表面修饰检测抗体和大量单链ＤＮＡ分子，同时在ＭＮＢｓ表面修饰捕??获抗体；然后，通过抗原抗体的特异性结合作用形成ＡｕＮＰｓ－抗原－ＭＮＢｓ复合物，??利用磁分离技术将其分离后，将单链ＤＮＡ分子从ＡｕＮＰｓ上解离下来，并利用银??４??

过在ＡｕＮＰｓ和ＭＮＢｓ上修饰不同的抗体和ＤＮＡ序列，实现了蛋白质的多重检??测５２。Ｊｉａｎｇ课题组利用ＭＮＢｓ富集ＤＮＡ分子，也实现了蛋白质的灵敏检测５３，??如图１－２Ｂ，首先，构建检测抗体和大量双链ＤＮＡ分子修饰的磁纳米探针，同时??将目标物固定在基底上；接着，通过抗原和抗体的免疫结合作用，将磁纳米探针??固定在基底上，利用磁分离技术洗去多余探针；最后，在双链ＤＮＡ分子中插入??荧光染料，实现荧光信号的扩增。该方法实现了人免疫球蛋白ＧＯｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ??ＧｌｇＧ）的灵敏检测，检测限为３．０?ｆＭ。在此基础上，该课题组又分别引入杂交??链式反应（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ?ｃｈａｉｎ?ｒｅａｃｔｉｏｎ，?ＨＣＲ）和滚环扩增反应（Ｒｏｌｌｉｎｇ?ｃｉｒｃｌｅ??ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＲＣＡ），分别将检测限降低至?１４?ａＭ３４?和?８．３?ａＭ５５。??（Ａ）??ｆ?＾?＾??Ｕ？ｎ〇ｆ？ｖｃｌ＊?ＭＰ）?Ｐｔｔｌｍ?ｆ?－ｔ／Ｊ－?＾?＾Ａｒ＾＇??Ｖ８?ｊＬ＿?＜３?ｏｎ?Ｗ＞ｔ??Ｘ?ｅ？?Ｈ？＊?ｔｅ＊?？ＣＫ４ｍ（?ＭＭｒｗｄ??Ｓ?＞？＜？？■?Ｗｏ、?Ｓｔｅｐｓ??ＪＪｉＬ．??冬．ＯＨ＊?／?，，?＇?＇?二邊．．??Ｖ－一＾一？一?／?二．??Ｕ?（ＵＫ?？＜０＊＊＞?＃？？？?Ｗ??碰?Ｍ?

有利于信号的检出。因此，作为一种新型荧光探针，ＱＤｓ被广泛用于蛋白??质的灵敏检测。Ｚｈｅｎｇ课题组利用ＱＤｓ表面带负电和朊蛋白表面带正电的性质，??将ＱＤｓ用于朊蛋白的检测６５，原理见图１－３，在ＱＤｓ过量的情况下，ＱＤｓ与朊??蛋白静电结合，形成庞大的ＱＤｓ－阮蛋白聚合物，改变ＱＤｓ的荧光特性，通过测??定荧光信号进行定量。Ｘｕ课题组利用不同尺寸ＱＤｓ荧光光谱不同的特点，构建??了一个蛋白质多重分析方法６６，该方法构建了?ＱＤｓ标记的检测抗体，利用抗体－??抗原的特异性结合作用，实现了?５种目标物的同时检测。Ｌｉｕ等以ＱＤｓ为荧光标??记构建了一个磁球微阵列，实现了肺癌标志物ＣＥＡ、ＣＹＦＲＡ２１－１和ＮＳＥ的灵敏??检测，检测限分别为?０．１９?ｎｇ／ｍＬ、０．９７?ｎｇ／ｍＬ?和?０．３７?ｎｇ／ｍＬ６７。??？?＊?？?＿??－?＊?．ｍｔ＊．?＊??－．、Ｔ＇??？＇?ｍｆ?ｉｍ??图１－３?ＱＤｓ用于蛋白质的灵敏检测６５??金纳米颗粒（ＡｕＮＰｓ）是一种直径在ｌ￣１００ｎｍ之间的微小金颗粒，具有较??高的电子密度和介电特性
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 张华金 ,李娜 ,杜学志;干扰素的剂型及临床应用[J];华西药学杂志;2004年01期

2 李岩,邵念鹏,彭玉麟;γ干扰素的研究与临床应用(综述)[J];河北省科学院学报;2001年03期

本文编号：2875092