基于PET分子影像的普鲁士蓝纳米酶治疗脑缺血的基础研究

发布时间：2020-11-09 06:00

　　 缺血性脑卒中是全球主要致死性疾病之一,占全球死亡病因的5.2%。缺血性脑卒中通常是由血栓或栓子阻断大脑动脉血流供应,引起短暂或永久的脑血流减低所致。短暂性脑血供减少或丧失会触发脑缺氧-再灌注损伤,诱发大量活性氧/氮(reactive oxygen and/or nitrogen species,ROS/RNS 或 RONS)的产生。大量产生的RONS被认为是介导脑缺血-再灌注后神经元损伤最主要的因子,靶向RONS的抗氧化剂也由此成为一种能保护神经元免受RONS损伤和改善缺血性脑卒中预后的理想药物。目前,以新型纳米材料为基础合成的抗氧化纳米酶,因具有稳定的酶样活性、较强的抗氧化性质、良好的生理稳定性和较低的合成成本等优势引起了广泛关注。普鲁士蓝是一种美国食品药品监督管理局批准的铯和铊中毒的解毒剂,具有良好的生物安全性。基于普鲁士蓝合成的纳米粒因具有磁/光性能、可控的理化性质以及多孔结构等优势,已被开发为多模态显像探针、药物载体和光热转换剂等,在生物医学研究领域受到广泛关注。此外,普鲁士蓝纳米粒因其具有过氧化氢酶、超氧阴离子歧化酶和过氧化物酶等多酶样活性,可作为有效的RONS清除剂。然而,其能否起到保护神经元、改善缺血性脑卒中等RONS相关疾病预后的作用,尚无研究报道。正电子发射计算机断层显像(positron emission tomography,PET)是一种无创的可在细胞和分子水平上在体显示机体生物活动的新型分子影像技术。18氟-脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)PET成像能够反映机体细胞水平的葡萄糖代谢情况和细胞的活性,已用于多种神经系统疾病的诊断和疗效评估。本研究旨在通过提出绿色安全、简单便捷的合成方法,合成新型空心普鲁士蓝纳米酶(hollow Prussian blue nanozymes,HPBZs),并将其应用于缺血性脑卒中,从纳米技术、体外细胞和活体动物水平,探究其神经元保护作用及相关机制;同时,基于18F-FDG PET成像,活体评估HPBZs在缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用和效果,为普鲁士蓝纳米粒的临床转化提供研究基础。第一部分HPBZs合成、表征以及性能检测本部分研究通过研发Bi3+介导的无模板空心纳米粒合成方法,成功制备了HPBZs。该方法合成路径简单,无需复杂的预处理和苛刻的合成条件。制备的HPBZs为直径约65 nm、大小均一、分散均匀的空心纳米粒,在生理环境下能够维持稳定的水合动力学直径,表现出良好的生物学稳定性。此外,HPBZs具有多酶样活性、可变的价态和较强的氧化还原性能,不仅能够将毒性ROS转化为无毒的水分子和氧气,而且能够有效地清除RNS。同时,空心结构赋予HPBZs更大的比表面积,增大HPBZs与RONS接触面积,从而提高HPBZs清除RONS的效能。本部分研究结果为HPBZs在缺血性脑卒中中清除大量产生的RONS从而发挥神经保护作用提供了实验依据。第二部分HPBZs发挥细胞保护作用的体外细胞实验研究该部分主要研究了 HPBZs在体外细胞水平的保护作用,并进一步探讨其发挥细胞保护作用的机制。首先,我们建立了体外细胞氧化应激模型,结果显示,HPBZs能够抵抗氧化应激损伤,保护神经元;随后构建了氯化钴诱导的体外细胞缺氧模型,结果显示HPBZs能够降低RONS水平,调控凋亡蛋白p53和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,从而保护缺氧受损的神经元;此外,我们还构建了体外炎症模型,结果表明HPBZs能够通过减少炎症介质环氧合酶-2和诱导型一氧化氮合酶的表达,抑制炎症因子IL-1β的释放,发挥体外细胞抗炎作用。综上所述,HPBZs可能通过减少RONS、抵抗细胞凋亡和抑制炎症反应,从而发挥细胞保护作用。第三部分HPBZs发挥神经保护作用的动物实验研究该部分主要研究了 HPBZs对缺血性脑卒中大鼠的神经元保护作用,并进一步探索其发挥神经元保护作用的机制。我们采用经典的致大鼠大脑中动脉梗阻线栓法构建了脑缺血-再灌注损伤大鼠模型,并于脑缺血-再灌注前2天、脑缺血-再灌注后1小时、4小时或8小时侧脑室注射HPBZs(40 μg/mL,10μL),结果显示,脑缺血-再灌注前2天或缺血-再灌注后1小时侧脑室注射HPBZs可显著减少大鼠脑梗面积、改善大鼠脑缺血区葡萄糖代谢和促进大鼠神经行为学功能恢复;进一步分子生物学实验结果提示HPBZs可能通过降低脑内RONS水平、抑制神经胶质细胞增生和抵抗神经元凋亡,发挥神经元保护作用以拮抗缺血诱导的神经元损伤。同时,初步的活体生物安全性评估(包括18F-FDG PET成像、神经行为学测试以及2,3,5-三苯基氯化四氮唑染色分析)结果显示,HPBZs具有良好的生物安全性。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R743;R817.4
【部分图文】：

在磁搅拌的作用下使铋离子充分溶解并与ＰＶＰ反应；同时将Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］、ＰＶＰ和??１Ｍ盐酸在磁搅拌的作用下充分溶解；最后，将上述两种反应溶液混合摇勻，放置??于８０°Ｃ烘箱中反应２４小时，即可获得ＨＰＢＺｓ?（图１．１）。ＨＰＢＺｓ合成路径简单，??无需复杂苛刻的合成条件。??ｆ?ＩＷＣ＇ＮＵ＇－谷【ＦｒｔＣＮＷ＊』．Ｆ〇‘?［ＦｃｉＣＮＵ＊－Ｆｃ??醒＋ｂ－飘４?ｉ?〇??Ｂｉ．，ｐｖｐ?ｉｍｉ－ｎｗＦ－ｐｖｐ?｜??＇＇?ｘ?ＢｎＦｄＣＮＵ＇＾ＩＦｅｉＣＮｖｒ?Ｂｉ?ｈｏｌｌｏｕ?Ｐｒｕｓｓｉａｎ?ｂｌｕｅｎａｎｏｅｎｚ＞ｍｅｓ??ｉｔ?Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ?ｓｔａｔｅ?｝ｅ?Ｊ??〇?Ｂｉ！?－ＰＶＰ?＊｜Ｆｅ（ＣＭ?｜＊－ＰＶＦ＊?＿?［Ｉ?〇＜〇?Ｊ４?．ＰＶＰ?▲ｈｒ＇．－ＰＶＰ??图１．１?ＨＰＢＺｓ合成路径示意图。??此外，我们发现，在没有添加Ｂｉ（Ｎ０３）３条件下，普鲁士蓝纳米酶呈现实心球??型（图１．２ａ）；而在添加Ｂｉ（Ｎ０３）３后，它们开始呈现空心结构（图１．２ｂ－ｅ），且??ＨＰＢＺｓ的空腔大小随Ｂｉ（Ｎ０３）３的浓度变化而改变（图１．２ｂ－ｅ）。当Ｂｉ（Ｎ０３）３增加??到０．５?ｍｍｏｌ时，ＨＰＢＺｓ直径甚至小于１００?ｎｍ?（图１．２?ｅ）。随着Ｂｉ３＋的过度加入，??电感耦合等离子体质谱检测到的Ｆｅ：?Ｂｉ的混合摩尔比保持在１７：?１的水平。ＢＰ＋离??子在ＨＰＢＺｓ的空腔形成过程中发挥着至关重要的作用（图１．２ｆ）。??ｍｍｍ??５??

?１?Ｍ?２?Ｍ??图１．３多种浓度盐酸混合下普鲁士蓝纳米酶的透射电镜图。在磁搅拌下，不同浓度的盐酸（浓度??分别为?０．０００１、０．０１、０．１、１?和?２Ｍ）与?ＰＶＰ?（５ｇ）、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３％ｍｇ）混合制备的普鲁士蓝??纳米酶的透射电镜图像。??ｆｉ＾ＳＬ?°??ＨＢＢｆＢ??图１．４?Ｇｄ＿１＋取代Ｂｉ３＋制备的普鲁士蓝纳米酶的透射电镜图像。在磁搅拌下，将ＰＶＰ?（５ｇ）、??Ｇｄ（Ｎ０３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３９６ｍｇ）和盐酸溶液（１Ｍ，?４０ｍＬ）混合，得到澄瀆混合溶液，后??将盛有该溶液的小烧瓶放入８０°Ｃ的烘箱内２４小时。随后进行离心、蒸馏水多次洗涤，最终获??得实心的Ｇｄ３＋－普鲁士蓝纳米酶。??３．３?ＨＰＢＺｓ的表征??为明确所制备的ＨＰＢＺｓ的物理化学特性，我们对ＨＰＢＺｓ进行了详细的表征。??从透射电镜图（图１．５?ａ），我们观察到，所制备的ＨＰＢＺｓ的直径约为６５?ｎｍ，大小??均一，具有明显的空心结构和良好的单分散性。电子衍射图（图１．５?ｂ）和Ｘ线衍??射图（图１．６）显示所制备的ＨＰＢＺｓ具有良好的结晶性。进一步分析Ｘ线衍射图??（图１．６）

纳米酶的透射电镜图像。??ｆｉ＾ＳＬ?°??ＨＢＢｆＢ??图１．４?Ｇｄ＿１＋取代Ｂｉ３＋制备的普鲁士蓝纳米酶的透射电镜图像。在磁搅拌下，将ＰＶＰ?（５ｇ）、??Ｇｄ（Ｎ０３）３、Ｋ３［Ｆｅ（ＣＮ）６］?（３９６ｍｇ）和盐酸溶液（１Ｍ，?４０ｍＬ）混合，得到澄瀆混合溶液，后??将盛有该溶液的小烧瓶放入８０°Ｃ的烘箱内２４小时。随后进行离心、蒸馏水多次洗涤，最终获??得实心的Ｇｄ３＋－普鲁士蓝纳米酶。??３．３?ＨＰＢＺｓ的表征??为明确所制备的ＨＰＢＺｓ的物理化学特性，我们对ＨＰＢＺｓ进行了详细的表征。??从透射电镜图（图１．５?ａ），我们观察到，所制备的ＨＰＢＺｓ的直径约为６５?ｎｍ，大小??均一，具有明显的空心结构和良好的单分散性。电子衍射图（图１．５?ｂ）和Ｘ线衍??射图（图１．６）显示所制备的ＨＰＢＺｓ具有良好的结晶性。进一步分析Ｘ线衍射图??（图１．６），发现所制备的ＨＰＢＺｓ的峰与标准卡片中的普鲁士蓝峰（ＰＤＦ：?７３－０６８７）??一致
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本文编号：2875998