缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测体系建立及临床评价

发布时间：2020-11-12 05:36

　　 研究目的地中海贫血(简称“地贫”)是全球最常见单基因遗传病之一,临床主要分为α-地中海贫血和β-地中海贫血。此病无有效治疗手段,通过人群分子筛查和基因诊断,确定携带致病基因的高风险夫妇,并对孕期胎进行产前诊断从而避免重症患儿的出生,是国内外公认的首选预防措施。就目前对于缺失型α-地中海贫血的检测方法而言,现有的技术方案都存在优势和一定的局限性,其中,成本过高,操作繁琐,开管操作存在污染隐患是最大的限制。本研究的目的是建立一种快速准确,简单高效,低成本检测α-珠蛋白基因大片段缺失新方案,有效解决目前检测方法存在的局限性。研究方法依据缺失型α-地中海贫血的分子机制,不同α-缺失型地中海贫血的缺失片段大小及断裂位点存在差异,因此,只要能检测出截短后序列,即可对相应类型地中海贫血进行准确分类。为此,本研究以正常个体及中国人群中常见α-缺失地贫类型:--SEA/,-α3 7/,-α4.2/和相对少见α-缺失地贫类型:--Thailand/为研究对象,根据缺失片段差异,在适当位置设计相应引物和探针,通过对该体系的引物浓度,探针浓度,PCR Buffer浓度,检测模板量,DNA聚合酶等组分及复性温度,循环数等反应条件进行一系列的优化与调整,最终确定缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测体系。为了探讨其临床应用的可行性,本研究又对该检测体系的灵敏度,特异性,准确率,重复性等进行了评估。研究结果依据实验目的和实验方案,通过具体实施,验证了缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测方案的可行性并确立了检测体系,此体系可对浓度大于或等于4ng/ul(磁珠法,柱式法,酚氯仿提取法)的不同基因型α-缺失地中海贫血样本实现准确分型,检测准确率为100%。四个通道批内重复性均小于0.50%,批间稳定性均小于0.70%,满足体外诊断试剂质量要求(变异系数不超过15%),达到临床应用的要求。2000例临床样本评估显示,缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测方法与传统方法(Gap-PCR或MLPA)比较,此方法可对不同基因型α-缺失地中海贫血样本实现快速、高效、准确分型。研究结论通过本研究,从方法学上建立了一种缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测体系,有效解决了传统方法成本过高和操作繁琐的局限,以及PCR产物开管操作易污染的不足。可实现单管反应,检测三种中国南方人群常见缺失型α-地中海贫血类型和一种相对少见缺失型α-地中海贫血类型,极大提高了工作效率,为缺失型α-地中海贫血的分子诊断和疾病防控提供新的技术选择。地中海贫血是最常见的单基因遗传病,也是广西地区发病率最高的疾病。在日常工作中我们经所建立的缺失型α-地中海贫血荧光探针解链分析检测方法发现一位患者的α-地中海贫血常见基因检测结果与血液学检测结果不相符,通过对先证者及核心家系成员HBA1和HBA2的测序验证,证实此患者在α2基因的PolyA区HBA2:c.*64(TC),68(AC),71(GA),74(CA),82(GA),92(AG),98(TC)位点存在突变并同时合并-SEA/αα。这是一种罕见突变引起的hemoglobin H(HbH)病。在随后的工作中,我们另发现两例非亲缘关系的患者存在此种类型突变,可见此种突变并不是一种偶然现象,并在中国广西地区具有一定的发生率,分析其血液学表型,此种地中海贫血表现为中度贫血,在临床诊断和遗传咨询中应对其予以重视。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R556.61;R446.1
【部分图文】：

使得模板与杂交探针不能匹配，则连接反应无法进行。连接反应结束后，??通用引物扩增连接好的探针，最后，通过全自动遗传分析仪分离扩增产物，借??助分析软件对所得结果进行判断。扩增原理见图１－３。??５??

Ｆｉｇｕｒｅ?１－３．?ＭＬＰＡ?ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ??此技术尽管能对一个碱基的突变进行检测，但同样存在操作复杂、实验成??本高、开管操作存在污染等问题。随着分子诊断技术的发展，基因芯片在疾病??的诊断中所起到的作用也开始凸显出来，基因芯片的测序原理是杂交测序方法，??即通过与一组已知序列的核酸探针杂交进行核酸序列测定的方法，在一块基片??表面固定了序列己知的靶核苷酸的探针。当溶液中带有荧光标记的核酸序列与??基因芯片上对应位置的核酸探针产生互补匹配时，通过确定荧光强度最强的探??针位置，获得一组序列完全互补的探针序列，据此可重组出靶核酸的序列。以??上方法都为分子诊断技术的发展发挥了巨大的作用，但对于缺失型（Ｘ－地中海贫??血的检测存在工作量大，检测通量小，操作繁琐，检测成本高等技术局限，难??以实现自动化和标准化，及当前缺失型（Ｘ－地贫的大规模人群分子诊断需求。??６??

?ｈ?＼淬灭基团??图３－２．多重巢式非对称荧光解链分析检测缺失型ａ－地中海贫血检测方案示意图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－２．?Ｍｕｌｔｉｐｌｅ?Ｎｅｓｔｅｄ?Ａｓｙｍ
【参考文献】

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本文编号：2880320