miRNA在辐射诱导肺上皮间质转化中的作用及机制研究

发布时间：2020-11-18 13:50

　　 目的:鉴定γ射线照射后肺上皮细胞中miRNAs的差异表达谱,获取辐射致差异表达miRNAs的生物学信息;研究电离辐射致差异表达的miRNAs在辐射诱导肺上皮间质转化中的作用及其相关机制。方法:用20 Gy的~(60)Coγ射线单次全胸部照射C57BL/6小鼠,继续饲养14 d后,取肺组织提蛋白用于Western blot检测,观察E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist等蛋白的变化;分析miRNA芯片结果以鉴定照射后肺细胞中miRNAs的差异表达谱。~(60)Coγ射线6 Gy照射A549细胞和BEAS-2B细胞,48 hr后,用倒置显微镜观测细胞形态,用Western blot技术鉴定EMT相关蛋白的表达。Real-Time PCR方法验证部分显著性差异表达的miRNAs,通过TargetScan、miRDB和microT-CDS预测差异miRNAs的靶基因,DAVID、KEGG和DIANA等在线工具进行生物信息学分析,结合文献调研进行预测分析。通过细胞转染技术结合miRNA模拟物和miRNA抑制剂,在A549和BEAS-2B细胞中进行功能获得性/缺失性实验,探究miRNAs在IR诱导的EMT中的作用。通过生物信息学、RT-qPCR、Western blot和双荧光素酶报告基因等技术确定miRNAs在IR诱导的EMT中起作用的靶基因。使用细胞免疫荧光技术检测细胞内E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Twist等蛋白的荧光强弱,以此来辅助Western blot结果。通过RT-qPCR和Western blot技术检测miRNA靶基因的下游通路蛋白的表达变化和活化情况,进一步探讨miRNA介导IR诱导的EMT的相关机制。结果:用20 Gy的~(60)Coγ射线单次全胸部照射C57BL/6小鼠,14 d后小鼠肺组织内发生EMT。用6 Gy的~(60)Coγ射线照射的细胞,48 hr后细胞形态已从上皮样转变成间充质样,且E-cadherin表达减少,N-cadherin、Vimentin和α-SMA表达增多。小鼠肺组织miRNA芯片结果分析得到10个差异成熟mmu-miRNA,其中5个上调,5个下调,通过物种保守性分析类推到hsa-miRNA有7个,上调的有hsa-miR-193a-3p,hsa-miR-150-5p,hsa-miR-362-3p和hsa-miR-21-5p,下调的有hsa-miR-541-5p,hsa-miR-486-3p和hsa-miR-34a-5p,Real-Time PCR方法验证到这7个miRNA在照射后的A549和BEAS-2B中的表达变化与芯片结果一致,P0.05,差异具有统计学意义。miRNAs靶基因并集显著性KEGG通路富集到与EMT相关的通路有ErbB信号通路、TGF-β信号通路、MAPK信号通路、Wnt信号通路和PI3K-Akt信号通路,表明这7个miRNA可能是IR诱导EMT的潜在调节分子。miRNA芯片分析发现miR-21的表达在受照射的肺组织中上调。我们发现miR-21的过表达显著促进纤维化EMT,miR-21的下调阻止了IR诱导肺上皮细胞纤维化EMT。证实PTEN是照射后miR-21的直接靶标。miR-21模拟物显著诱导p-Akt,抗miR-21显著抑制IR介导的PTEN水平的降低和Akt磷酸化的增加;在A549和BEAS-2B细胞中证实了辐射后miR-34a-5p和miR-541-5p的表达均下调。抑制miR-34a-5p能显著促进EMT,miR-34a-5p过表达抑制IR诱导的EMT。证实miR-34a-5p靶向调控的CD44和SNAI1在照射后的肺上皮细胞中表达上调,参与IR诱导的EMT;抑制miR-541-5p能显著促进EMT,miR-541-5p过表达抑制IR诱导的EMT。证实miR-541-5p靶向调控的SMAD2、SNAI2和COL1A2在照射后的肺上皮细胞中表达上调,参与IR诱导的EMT。结论:1.在肺上皮细胞中,IR能上调miR-193a-3p、miR-150-5p、miR-362-3p和miR-21-5p的表达,下调miR-541-5p、miR-486-3p和miR-34a-5p的表达;2.IR诱导的miR-21通过miR-21/PTEN/Akt途径促进IR诱导的肺纤维化EMT;3.miR-34a-5p可能通过沉默CD44和SNAI1抑制IR诱导肺上皮间质转化和RIPF;4.miR-541-5p可能通过沉默SMAD2、SNAI2和COL1A2抑制IR诱导肺上皮间质转化和RIPF。
【学位单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R730.55
【部分图文】：

化初始阶段的主要启动因素[28, 29]。在纤维化组织中 36%的新增成纤维细胞来自原位上皮细胞的 EMT[30]。并且在 IPF 患者肺组织和纤维化动物肺组织中发现，约 5%-20%的细胞发生 EMT[31]。1.3 参与 EMT 的信号通路许多信号通路可以诱导 EMT 发生，进而导致肺纤维化，如 TGF-β 信号通路、PI3K-AKT 信号通路、Hedgehog 信号通路、Wnt/β-catenin 信号通路、EGFR 信号通路、MAPK 信号通路、Nocth 信号通路及 NF-κB 信号通路[32-34]（图 1.1）[26]。这些信号通路能够激活 EMT 转录因子如 LEF，Snail，Slug，FOX1/2，ZEB1/2和 Twist，从而抑制上皮标志物基因的表达并激活 EMT[35]。其中 Twist 是一种基本的转录因子，能够作为转录激活剂来增强 N-cadherin 的表达，诱发 EMT 的能力很强[36]，Twist 也可以显著影响 Akt 信号通路的活性[37]，有学者认为 Akt 和Twist 形成了一种正反馈调节，从而引起了一系列促进 EMT 功能的事件发生[22]。

因子[46]。MiRNA 普遍存在于大多数真核生物中，其产生到形成活性 RNA 诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, RISC）的过程涉及许多酶的切割[38]。具体过程如下[47]：首先，在细胞核中 RNA 聚合酶 II 转录 miRNA 相关基因形成初级 miRNA（pri-miRNA），pri-miRNA 有上千个核苷酸，包含 5’ 帽结构和 3’多聚（A）尾。然后，通过核糖核酸酶 III Drosha 加工该初级产物，生成释放长度约为 70-80 个核苷酸的 miRNA 前体（pre-miRNA），呈现 RNA 发夹环结构[43]。之后，pre-miRNA 通过核膜上的 Exportin-5 主动输出到细胞质中，在胞质中被 Dicer复合物切割，去除环区域并提供通常为 22 个左右核苷酸的成熟双链 miRNA，其中一条 RNA 链与 argonaute 蛋白（AGO）结合，产生特异性结合 mRNA 靶 3’端非翻译区（3’UTR）的 miRNA 诱导的沉默复合物（miRISC）[48]。成熟的单链miRNA 通过与 mRNA 的 3’UTR 完全互补的方式降解靶 mRNA，而部分互补则导致 mRNA 去除或翻译受损表达减少[42, 49-51]。

照射 C57BL/6 小鼠可诱导肺上皮间o γ 射线单次局部（胸部）照射 C肺上皮细胞发生 EMT 是肺纤维化60Co γ 射线胸部照射小鼠后 14 天组 C57BL/6 小鼠用60Co γ 射线 2常规饲养 14 天后，脱颈处死小鼠取测电离辐射对小鼠肺组织细胞中 E对照组相比较，60Co γ 射线 20 Gy达量明显减少，间质标志 N-cadhe 的转录因子 Twist 的表达量也明显生 EMT。
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本文编号：2888788