细菌感染标志物快速定量检测方法的建立及初步应用

发布时间：2020-11-20 03:22

　　 背景脓毒症是机体对于感染的失控反应所导致的威胁生命的器官功能障碍,全球每年脓毒症患病人数超过1900万,其中有600万患者死亡,病死率超过1/4,存活的患者中约有300万人存在认知功能障碍。造成如此高的病死率就是由于脓毒症以误诊、漏诊,所以能及时准确检测细菌感染标志物可以辅助诊治脓毒症,降低病死率。其中降钙素原(procalcitonin,PCT)和白介素6(interleukin 6,IL-6)作为细菌感染标志物已广为认可,它们均与细菌感染严重程度呈正相关,PCT在判断细菌和非细菌性感染时较为特异,IL-6动态监测利于判断诊治效果和预后。健康人群中PCT和IL-6的浓度分别为小于0.05ng/mL和约为6 pg/mL,而在严重细菌感染发生时,又可以分别可高达100 ng/mL和1000pg/mL。现行的检测方法以酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化学发光法(chemiluminescent immunoassay,CLIA)为主,ELISA操作复杂、耗时长、步骤多、价格昂贵、批量操作,中间过程受影响因素较多,CLIA操作均相对复杂、耗时较长、需要大型专业的设备、价格稍贵。现在政府和卫健委正大力推进分级诊疗和发展社区门诊等基层医疗机构,而基层医疗机构对感染疾病的诊治往往依靠经验,易造成脓毒症的误诊、漏诊和抗生素滥用,所以需要与之相适应的PCT和IL-6检测方法,ELISA和CLIA对于这样的基层医疗机构来讲适用性不强。所以现在需要一种快速简便、易操作和利于基层医疗机构推广的方法检测PCT和IL-6,有助于临床及时有效地诊治脓毒症。免疫层析技术(immunochromatography assay,ICA)是也称作侧向免疫分析法(lateral flow assay,LFIA),是一种结合薄层色谱技术和免疫识别反应的固相免疫分析法,为即时检测(point of care testing,POCT)提供了一个很好的平台,具有快速、简便、易操作等优点,广泛应用于金属离子、核酸、蛋白质和细菌等物质的检测。免疫层析技术的核心就是标记物,应用到免疫层析的标记物有胶体金、碳纳米材料、上转换发光纳米微球(up-converting phosphor nanoparticles,UCP)、量子点(quantum dots,QDs)、铕纳米微球(europium nanoparticles,Eu-np)和磁性纳米材料等,而其中Eu-np有着独特的光学性质:荧光寿命长,良好的光稳定性,stokes位移大(超过150nm),激发光谱和发射光谱无交叉,特征峰非常尖锐,标记物体积小,标记物不会影响被标记物(尤其对蛋白质的影响小)的空间立体结构,保证了被标记物物化性质的稳定性。由于Eu-np独特的光学性质,可很大程度降低非特异性荧光信号而获得高灵敏度。通过检测/质控(T/C)比值可以对PCT和IL-6进行定量检测。目的本研究根据时间分辨技术和免疫层析技术的原理,以试纸条为载体,运用便携式免疫荧光分析仪为检测平台,研制可快速、简便、定量检测PCT和IL-6的时间分辨免疫层析试纸条,为基层医疗机构可以快速准确诊断脓毒症奠定了基础。方法1.PCT时间分辨免疫层析试纸条的研制:Eu-np活化后分别与鸡IgY和PCT捕获抗体MJG03相偶联得到Eu-np-鸡IgY和Eu-np-MJG03复合物,复合物按各自比例稀释后喷到结合垫干燥。NC膜用稀释的PCT检测抗体MJG05包被两条T线,用羊抗鸡IgY包被一条C线,然后37℃干燥。组装完成后,血清样品用样品稀释液作等体积稀释后加到加样孔,反应15min后用便携式荧光仪检测,得到(T_1+T_2)/C比值,根据在荧光仪中设置好的标准曲线,直接得到PCT浓度。2.PCT时间分辨免疫层析试纸条的优化及初步应用:PCT试纸条从T线划膜浓度、结合垫喷膜浓度和检测时间3个方面优化,从线性、灵敏度、精密度、特异性、回收率、临床标本比对6个方面进行性能评估。3.IL-6时间分辨免疫层析试纸条的研制:Eu-np活化后分别与鸡IgY和IL-6捕获抗体MIS02相偶联得到Eu-np-鸡IgY和Eu-np-MIS02复合物,复合物按各自比例稀释后喷到结合垫干燥。NC膜用稀释的IL-6检测抗体MIS01包被作为T线,用羊抗鸡IgY包被一条C线,然后37℃干燥。组装完成后,血清样品直接加到加样孔,反应15min后用便携式荧光仪检测,得到T/C比值,根据在荧光仪中设置好的标准曲线,直接得到IL-6浓度。4.IL-6时间分辨免疫层析试纸条的优化及初步应用:IL-6试纸条从检测时间进行优化,从平行测试、线性、灵敏度、回收率、精密度、特异性、临床标本比对7个方面进行性能评估。结果1.本PCT检测方法线性良好,线性范围为0.05~100ng/mL,灵敏度为0.03ng/mL,与CRP、IL-6、IL-8、TNF-ɑ和RA无交叉反应,批内精密度变异系数(coefficient of variation,CV)和批间精密度CV分别为1.39%~5.42%和2.00%~6.86,回收率介于95%至101%之间,与AE-180全自动化学发光免疫分析仪作回归分析,结果一致性较好:y=0.9011x+0.4137(n=95,r=0.9936,p0.01),阳性符合率96.61%,阴性符合率94.44%,假阳性率5.56%,假阴性率3.39%和诊断符合率95.53%。2.本IL-6检测方法线性良好,线性范围为2~500 pg/mL,灵敏度为0.37 pg/mL,与PCT、IL-8和CRP无交叉反应,批内精密度CV和批间精密度CV分别为5.92%~8.87%和7.59%~9.04%,回收率介于102%至106%之间,与SEIMENS全自动化学发光免疫分析仪作回归分析,结果一致性较好:y=0.9502 x+6.1397(n=214,r=0.9757,p0.01)。结论1.在不用NHS而单用EDC时成功活化铕纳米微球,可减少操作步骤和节约试剂。2.PCT检测和IL-6检测快速,仅加样15 min后便可得到检测结果,优于1 h左右出结果的CLIA和5 h左右出结果的ELISA。3.PCT检测是仅需要50μL血清和50μL样品稀释液混匀后加样,待反应完成便可检测;IL-6检测仅需血清70μL,待反应完成便可检测。两种检测方法均为两步法,操作简便,标本用量少。4.检测仪器便宜小型、占地面积小,非专业人员也可操作,节约试剂,适于基层医疗机构推广使用。5.PCT免疫层析试纸条双T线捕获PCT抗原的能力更强,有助于提高了灵敏度和线性;在0.05~100 ng/mL范围内线性范围良好(Y=0.0747X+0.5246,R~2=0.9904),灵敏度为0.03 ng/ml,批内精密度CV≤8.76%,批间精密度CV≤6.86%,特异性良好,与AE-180全自动化学发光免疫分析仪相关性良好(Y=0.9011X+0.4137,R2=0.9873,p0.01),符合临床检测要求。6.IL-6免疫层析试纸条在2~500 pg/mL范围内线性良好(Y=0.0020 X+0.0051,R2=0.9988),灵敏度为0.37 pg/mL,批内精密度CV≤8.87%,批间精密度CV≤9.04%,特异性良好,与SIEMENS IMMULITE 1000全自动化学发光免疫分析仪相关性良好(Y=0.9502X+6.1397,R2=0.9517,p0.01),符合临床检测要求。
【学位单位】：中国人民解放军陆军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R446.5;R459.7
【部分图文】：

图 2.1 抗体标记示意图组装品垫(玻璃纤维膜 SB08)切成 21 mm*30 cm 的条带，把结合垫（聚 9 mm*30 cm 的条带，然后分别在样品垫预处理液和结合垫预处理干燥箱中干燥 4 h 备用。膜贴在 PVC 板上，在 NC 膜上分别包被用包被稀释液稀释好的羊和 PCT-MJG05 作为 C 线和 T1、T2线，划膜量均为 1 μL/cm，37 处理过的结合垫上喷上被喷膜稀释液稀释的 Eu-np-MJG03 和 Eu-n 为 150 倍稀释，喷膜量为 5 μL/cm，37 ℃干燥箱中干燥 6 h。0 %湿度环境下依次把干燥好的结合垫、预处理过的样品垫和吸水贴上 PVC 板，切成 4 mm 宽的试纸条（图 2.2），装入塑料卡盒中存备用。

图 2.2 PCT 试纸条示意图2.2.3 试纸条检测把试纸条从铝箔袋中取出，加入 100 μL 样本或标准品，反应一段时间后，把板条插入便携式荧光检测仪中检测，得到（T1+T2）/C(简化为 T/C)的比值，再根据仪器内置的 PCT 标准曲线，以此计算得到 PCT 的浓度。2.2.4 试纸条优化2.2.4.1 T 线划膜浓度优化方案 A：单 T 线浓度为 1 mg/mL；方案 B：T1和 T2线浓度分别为 1 mg/mL 和 0.5mg/mL；方案 C：T1和 T2线浓度均为 1 mg/mL 和 1 mg/mL；方案 D：T1和 T2线浓度分别为 1 mg/mL 和 1.5 mg/mL；方案 E：单 T 线浓度为 2 mg/mL。以此确定合适的包被浓度。2.2.2.2 结合垫喷膜浓度优化对 Eu-np-MJG03 分别进行 3、4 和 5 倍稀释，以此确定合适的喷膜浓度。

PCT阳性试纸条检测
【参考文献】

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本文编号：2890867