mcr-1基因在肠道病原菌中的分布特征与传播规律研究

发布时间：2020-11-21 22:49

　　 自中国首次发现可转移性粘菌素耐药基因mcr-1以来,全球范围内已有40多个国家和地区检测到了mcr-1基因。mcr-1基因可通过质粒或转座的形式在不同地区不同菌属之间扩散,不仅对公共健康造成巨大威胁,也给临床抗感染治疗带来重大挑战。目前检测到携带mcr-1基因的样本种类与分布地区众多,但样本来源主要集中在动物、生肉、环境与临床,其中临床分离得到的mcr-1阳性菌株相对较少。已报道的能够携带mcr-1的菌种主要为环境或院内感染相关的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌,而对于mcr-1在引起急性腹泻的肠致泻性大肠杆菌、沙门氏菌和志贺菌等重要肠道致病菌中的流行分布情况的研究较少。此外,mcr-1在肠道致病菌中的传播特性及mcr-1阳性菌的亲缘进化关系并不清楚,亟需开展研究。研究目的筛查从部分地区医院腹泻患者样本中收集的大肠杆菌、沙门氏菌和志贺菌等重要肠道致病菌,揭示mcr-1基因在肠道病原菌中的分布情况及传播规律;分析携带mcr-1肠道病原菌的耐药特点,为多粘菌素耐药菌的科学治疗提供依据;分析人源mcr-1阳性的大肠埃希菌、沙门菌和志贺菌的遗传特征,为有效监测和控制粘菌素耐药基因mcr-1在人群中的传播以及暴发流行的预警提供依据。研究方法采集腹泻患者临床样本及病人基本信息,按照《全国临床检验操作规程》对收集的腹泻标本进行菌株的分离培养与鉴定;利用PCR和Sanger测序对mcr-1基因进行筛检,通过微量肉汤梯度稀释法对mcr-1阳性菌进行抗生素敏感性分析;应用PFGE技术对携带mcr-1肠道病原菌进行分型;通过S1-PFGE技术与Southern-blot技术对携带mcr-1的质粒进行分型与定位;通过质粒接合转移实验检查mcr-1阳性质粒的传播特性;利用PCR、质粒测序和全基因组高通量测序技术对mcr-1阳性菌株的质粒特点、遗传多态性等分子特性进行研究。研究结果1.共收集或分离鉴定2003-2015年间的我国部分地区的肠道致病菌株共计16950株,其中志贺菌3821株、大肠杆菌1024株、沙门氏菌12105株。共检出76株mcr-1阳性菌株,其中包括志贺菌7株,沙门氏菌28株,大肠杆菌41株。其中非典型致病性大肠杆菌与鼠伤寒沙门菌的检出量最多。2.通过对就诊患者的基本信息进行统计与分析发现,仅12.86%(9/70)的mcr-1阳性菌分离于成年人样本,在所有人源性mcr-1阳性样本中有77.41%(54/70)的样本来源于4岁以下儿童,儿童患者的平均年龄仅为1.4岁。3.通过对mcr-1阳性菌进行抗生素敏感性分析发现,其中耐药率最高的3种药物分别为黏菌素100.00%(76/76)、磺胺异噁唑84.21%(64/76)和四环素78.95%(60/76);其中敏感性最高的三种药物分别为环丙沙星90.79%(69/76),头孢西丁89.47%(68/76)与阿莫西林克拉维酸钾80.26%(61/76)。4.mcr-1阳性菌株的多重耐药现象明显。有12株(15.79%)菌同时对第三代头孢和喹诺酮类药物耐药,69株(90.79%)菌同时对三种或三种以上抗生素耐药,只有2株菌仅对黏菌素一种药物耐药。mcr-1阳性大肠杆菌、沙门氏菌与志贺菌抗生素耐药谱有差异。5.所有mcr-1阳性肠道病原菌共检测到4种质粒骨架类型,分别为Inc X4,Inc I2,Inc HI2与Inc F型。6.mcr-1阳性大肠杆菌中Inc X4型质粒检出率最高(19/41,46.3%),沙门氏菌Inc H型质粒检出率最高(13/28,46.0%),志贺菌中只检测到Inc I质粒类型。7.大肠杆菌PFGE分析结果显示41株mcr-1阳性大肠杆菌基因组具有异质化特性。在28株沙门氏菌中检测到具有高度同源的优势菌株。8.通过SNPs进化分析树发现部分鼠伤寒沙门菌亲缘关系密切,可能是同一个流行的克隆群。研究结论1.在国内首次发现了携带mcr-1基因的人源性宋内志贺菌、人源性旺兹沃思和肠炎型沙门菌,在这些分离到的mcr-1基因的大肠杆菌中,非典型肠致病性大肠杆菌(a EPEC)与鼠伤寒沙门菌为优势型别,而这两种可导致医院感染和暴发性食物中毒,给公共卫生安全带来极大的威胁。2.在我国上海地区分离的mcr-1阳性肠道致病菌中,大肠杆菌中的阳性率(4.0%)显著高于沙门氏菌与志贺菌,并且在无症状人群中也检测到了mcr-1阳性菌株,意味着mcr-1阳性菌在部分地区已出现传播,引起感染。3.在携带mcr-1基因的样本中,来源于4岁以下儿童的样本相对较多,应加强对学校及家庭公共卫生安全知识的普及,增强个人消毒防护意识,减少食品与水源污染给儿童健康带来的威胁。4.mcr-1阳性肠道致病菌多重耐药的现象十分明显,携带mcr-1的多重耐药与泛耐药菌成为临床治疗中面临的更为棘手的问题。5.不同菌属的mcr-1肠道致病菌对相同药物的耐药差异明显,其中沙门氏菌对头孢菌素类和β内酰胺类抗生素表现出较高水平耐药,并且泛耐药现象显著;大肠杆菌对四环素类和磺胺嘧啶类抗生素表现出较高水平耐药;志贺菌中有4株同时携带阿奇霉素与第三代头孢菌素抗性,表现出多重耐药的表型特征。6.携带mcr-1的a EPEC型大肠杆菌的异质化趋势明显;在上海地区发现了收集于2012-2015年间的mcr-1阳性沙门氏菌优势克隆群,推测该克隆群在2015年间可能发生了传播造成了感染。7.肠道致病菌所携带的mcr-1质粒类型复杂多样,主要为Inc X4、Inc I和Inc H质粒类型,其中Inc I类型质粒广泛分布于本次检测的3种肠道致病菌中;其中致泻性大肠杆菌携带mcr-1质粒类型更复杂多样,以Inc X4和Inc I为主,沙门菌以Inc H类型质粒为主。8.在SNPs进化分析中亲缘关系密切的鼠伤寒沙门菌可能是同一个流行的克隆群。意义和创新1.迄今为止,我国还没有规模性的对mcr-1基因在人源性肠道病原菌中分布规律的调查分析,通过对部分地区医院腹泻患者样本中的肠道病原菌进行筛查,我们揭示了mcr-1基因在大肠杆菌、沙门氏菌、志贺菌三类肠道病原菌中的分布情况及传播规律,为控制黏菌素耐药性的传播提供了可靠的理论依据。2.通过对收集菌株的筛查,我们研究了mcr-1阳性人源性肠道病原菌在部分地区的分布状况、传播关系、耐药性特点、遗传多态性及传播机制,为mcr-1阳性肠道病原菌的危害评估提供了科学依据。3.通过基因组测序分析,我们研究了携带mcr-1质粒在肠道病原菌中的转移特性和不同菌属间携带mcr-1质粒的结构特点,为预防控制此类mcr-1基因的传播提供了理论依据。
【学位单位】：军事科学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R446.5
【部分图文】：

介导的能够水平转移的多黏菌素抗性基因 mcr-1最初是在2中国收集的大肠杆菌和肺炎克雷伯菌中发现的[1]。MCR-1胺转移酶家族，其蛋白的活性位点与磷酸甘油胺转移酶相似加到类脂 A 从而修饰 LPS，增加了 LPS 携带的正电荷，降S 结合的可能性，因此对多粘菌素类药物产生抗性，其作用色体突变导致的抗性[3]，LPS 在肺炎克雷伯菌中的调控机制菌素抗生素的抗性外，MCR-1 蛋白的存在还可以使菌株对溶在大肠杆菌中，MCR-1 蛋白的存在可以将菌株对多粘菌素的nimuminhibitoryconcentration，MIC）提高 4 到 8 倍。在没有菌素抗性的因素的作用下，仅通过 MCR-1 蛋白的作用便足以克雷伯菌等一些肠杆菌产生对多粘菌素的抗性。

第 41 页图 3. 1 Mate-pair 文库构建流程（1）基因组 DNA 的片段化处理。所需要的基因组 DNA 的质量约为 5μg，使用特定的配对转座酶，对基因组 DNA 进行片段化处理，对破碎后的片段通过磁珠进行片段大小的筛选，之后连接上生物素配对接头，再次用磁珠对加接头后的片段进行纯化。（2）链置换反应。使用多聚酶补平 DNA 由于片段化处理造成的缺口，在连接生物素连接头的 DNA 片段上有一条链的末端与连接头之间有一个小的缺口，链置换反应就是补平 DNA 为后面环化做准备，在操作过程中使用磁珠去除了样品中小于 1500bp 的小片段，仅保留了含有生物素的大片段。

（4）线性 DNA 的消化过程。通过在样本中加入 DNA 核酸外切酶去除所有以线性状态存在的 DNA，尽可能多的保留完整的环状 DNA。在灭活核酸外切酶之后需要加入停止环化反应的试剂灭活连接酶。（5）剪切环化DNA.使用超声破碎仪将环化的DNA用打断成约300-1000bp带有粘性末端的小片断，过程中用磁珠筛选与纯化片段（6）链霉亲和素珠子吸附，使用能够特异性吸附包含生物素化接头的磁珠筛选含有生物素接头的片段，去除其他片段。（7）末端修复补平。配置修复反应的体系 30℃孵育 30min，之后用磁珠纯化获得的片段。（8）片段加 A 尾。所有片段的 3’末端被加入一个 A 碱基，而与之互补配对的接头的 3’末端含有一个单个的 T 碱基，因此两条链可以配对连接。（9）在片段末端加接头，片段加上接头后需要用磁珠纯化，接头的添加过程如下。
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本文编号：2893719