10种虫媒病毒TaqMan一步法单重/多重荧光定量RT-PCR检测方法的建立及探索

发布时间：2020-12-05 23:28

　　目的:分析各种虫媒病毒的公共卫生学意义及其在贵州的传播风险,筛选出部分病毒作为监测对象,并基于TaqMan RT-PCR技术,建立出适合贵州省的快速、灵敏、特异的虫媒病毒检测方法。为贵州省重要病媒生物防控及病原检测技术平台建设提供技术支持。方法:1.查阅相关文献确定需要监测的虫媒病毒后,通过GenBank数据库获得各病毒的全基因序列,使用Bioedit软件对各病毒的全基因序列进行比对分析,找到高度保守区域,利用NCBI blast及DNAStar中primer select等软件辅助手动设计引物及TaqMan探针,并对多重组合中的多对引物探针的相互影响进行评价。2.运用体外转录方法合成靶基因的RNA模板,并以制备的RNA标准品为模板进行单重荧光定量RT-PCR检测,建立标准曲线,评价各体系的灵敏度及重复性;将所有病毒的引物-探针对之间做交叉反应试验,以评价各体系的特异性。3.在单重荧光定量RT-PCR的基础上,查阅文献,根据病毒所致疾病类型与种属分类情况将10种病毒初步分成三组,根据组合信息,在同一体系中同时加入多种引物探针,对多重荧光定量RT-PCR反应体系进行摸索,并通过对退火温度... 

【文章来源】：贵州医科大学贵州省

【文章页数】：78 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

DENV-1单重荧光RT-PCR扩增曲线及标准曲线

在 87.20%～102.00%之间，说明建立的单重荧光 RT-PCR 反应体系对于 RNA 模板的扩增比较完全，可以反映模板 RNA 的浓度；以 RNA 标准品拷贝数的对数值为横坐标，以 Ct 值的平均值为纵坐标，建立标准曲线，相关系数均在 0.99 以上，曲线具有良好的线性。扩增曲线结果及标准曲线见图 2-1～2-10。根据各种病毒的单重荧光定量 RT-PCR 检测体系的标准曲线，以 CT 值≤ 35 作为阳性标准，计算各引物-探针对单重检测体系的检出限，为 101～102copies/PCR，扩增片段大小及灵敏度结果见表 2-3。图 2-1 DENV-1 单重荧光 RT-PCR 扩增曲线及标准曲线Fig.2-1 Amplification curve and Standard curve for DENV-1 single-plex qRT-PCR assay

图 2-3 DENV-3 单重荧光 RT-PCR 扩增曲线及标准曲线Fig.2-3Amplification curve and Standard curve for DENV-3 single-plex qRT-PCR assay图 2-4 DENV-4 单重荧光 RT-PCR 扩增曲线及标准曲线Fig.2-4 Amplification curve and Standard curve for DENV-4 single-plex qRT-PCR assay


本文编号：2900279