靶向OXA23基因的CRISPR-Cas9载体系统构建
发布时间：2021-02-28 10:08
目的:本研究以质粒pet41a为载体骨架,通过双酶切法从质粒pwt-Cas9、pgRNA中获得目的基因片段,构建CRISPR-Cas9载体系统,建立一种行之有效的基因编辑的载体,为研究细菌耐药基因提供方法;使用热转化和电转化两种常用分子技术手段,制备感受态细胞并优化转化条件,获得最大的转化效率。方法:1.收集宁夏医科大学总医院2016-2017年临床分离鉴定的鲍曼不动杆菌菌株105株。2.进行药敏及PCR技术筛选对卡那霉素敏感且含有OXA23基因的菌株。3.选择质粒pet41a、pgRNA和pwt-Cas9,分析质粒核酸序列及酶切位点。使用限制性核酸内切酶XhoI和BgiII分别酶切质粒pet41a和pwt-Cas9,获得具有相同粘性末端的线性质粒片段,回收并用T4DNA连接酶连接,连接产物转化DH5α感受态细胞,转化菌涂布含卡那霉素的固体LB培养基平板进行阳性单克隆筛选并测序,构建的质粒命名为pet41-Cas9。使用BgiII和XbaI两种限制性内切酶分别酶切pet41-Cas9和pgRNA,经回收纯化、连接和转化后筛选阳性单克隆菌落并测序,重组质粒命名为pet41a-Cas9-s...
【文章来源】：宁夏医科大学宁夏回族自治区
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
OXA23基因PCR筛选鉴定
图 2 质粒 pET41a-Cas9-pgRNA 构建流程图ematic of construct recombinant plasmid: pET4表 3 质粒酶切信息Tab 3 Information of enzyme cut内切酶 目的片段大小（XhoI 和 BgiII 4131XhoI 和 BgiII 5805表 4 反应体系Tab 4 Reaction system体积（μl）
双酶切图 4 重组质粒 pet41a-Cas9 酶切验证Fig.4 Recombinant plasmid pet41a-Cas9 digestionM 为 DNA 标志物 Cas9 为质粒 pwt-Cas9 PCR 产物 1~15 随机筛选菌落 16 空白对照图 5 重组质粒 pET41a-Cas9 的 PCR 筛选鉴定Fig.5 PCR identification of recombinant plasmid: pET41a-Cas9
【参考文献】：
期刊论文
[1]碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌外排泵耐药机制研究[J]. 吴伟清,张彦鹏,李卓成. 广东医学. 2017(04)
[2]2005-2014年CHINET中国细菌耐药性监测网5种重要临床分离菌的耐药性变迁[J]. 胡付品,F.-P.Hu,Y.Guo,D.-M.Zhu,F.Wang,X.-F.Jiang,Y.-C.Xu,X.-J.Zhang,C.-X.Zhang,P.Ji,Y.Xie,M.Kang,C.-Q.Wang,A.-M.Wang,Y.-H.Xu,J.-L.Shen,Z.-Y.Sun,Z.-J.Chen,Y.-X.Ni,J.-Y.Sun,Y.-Z.Chu,S.-F.Tian,Z.-D.Hu,J.-Li,Y.-S.Yu,J.Lin,B.Shan,Y.Du,Y.Han,S.Guo,L.-H.Wei,L.Wu,H.Zhang,J.Kong,Y.-J.Hu,X.-M.Ai,C.Zhuo,D.-H.Su,Q.Yang,B.Jia,W.Huang. 中国感染与化疗杂志. 2017(01)
[3]一步法制备大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞及转化条件优化[J]. 张迹,李智,张宇,袁巧云. 江苏农业科学. 2016(12)
[4]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠. 遗传. 2015(10)
[5]大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[J]. 代军. 江苏农业科学. 2015(04)
[6]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[7]制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[J]. 朱森康,黄磊,李燕飞,钟卫鸿,徐志南. 生物技术通报. 2011(10)
[8]产OXA-23型碳青霉烯酶鲍氏不动杆菌引起医院感染的研究[J]. 王欢,沈定霞,闫中强,曹敬荣,刘朝军,陈荣,蒋伟. 中华医院感染学杂志. 2011(08)
本文编号：3055698
【文章来源】：宁夏医科大学宁夏回族自治区
【文章页数】：69 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
OXA23基因PCR筛选鉴定
图 2 质粒 pET41a-Cas9-pgRNA 构建流程图ematic of construct recombinant plasmid: pET4表 3 质粒酶切信息Tab 3 Information of enzyme cut内切酶 目的片段大小（XhoI 和 BgiII 4131XhoI 和 BgiII 5805表 4 反应体系Tab 4 Reaction system体积（μl）
双酶切图 4 重组质粒 pet41a-Cas9 酶切验证Fig.4 Recombinant plasmid pet41a-Cas9 digestionM 为 DNA 标志物 Cas9 为质粒 pwt-Cas9 PCR 产物 1~15 随机筛选菌落 16 空白对照图 5 重组质粒 pET41a-Cas9 的 PCR 筛选鉴定Fig.5 PCR identification of recombinant plasmid: pET41a-Cas9
【参考文献】：
期刊论文
[1]碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌外排泵耐药机制研究[J]. 吴伟清,张彦鹏,李卓成. 广东医学. 2017(04)
[2]2005-2014年CHINET中国细菌耐药性监测网5种重要临床分离菌的耐药性变迁[J]. 胡付品,F.-P.Hu,Y.Guo,D.-M.Zhu,F.Wang,X.-F.Jiang,Y.-C.Xu,X.-J.Zhang,C.-X.Zhang,P.Ji,Y.Xie,M.Kang,C.-Q.Wang,A.-M.Wang,Y.-H.Xu,J.-L.Shen,Z.-Y.Sun,Z.-J.Chen,Y.-X.Ni,J.-Y.Sun,Y.-Z.Chu,S.-F.Tian,Z.-D.Hu,J.-Li,Y.-S.Yu,J.Lin,B.Shan,Y.Du,Y.Han,S.Guo,L.-H.Wei,L.Wu,H.Zhang,J.Kong,Y.-J.Hu,X.-M.Ai,C.Zhuo,D.-H.Su,Q.Yang,B.Jia,W.Huang. 中国感染与化疗杂志. 2017(01)
[3]一步法制备大肠杆菌BL21（DE3）菌株感受态细胞及转化条件优化[J]. 张迹,李智,张宇,袁巧云. 江苏农业科学. 2016(12)
[4]CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在动物基因组定点修饰中的应用[J]. 周金伟,徐绮嫔,姚婧,余树民,曹随忠. 遗传. 2015(10)
[5]大肠杆菌感受态细胞制备及转化条件优化[J]. 代军. 江苏农业科学. 2015(04)
[6]CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术[J]. 方锐,畅飞,孙照霖,李宁,孟庆勇. 生物化学与生物物理进展. 2013(08)
[7]制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究[J]. 朱森康,黄磊,李燕飞,钟卫鸿,徐志南. 生物技术通报. 2011(10)
[8]产OXA-23型碳青霉烯酶鲍氏不动杆菌引起医院感染的研究[J]. 王欢,沈定霞,闫中强,曹敬荣,刘朝军,陈荣,蒋伟. 中华医院感染学杂志. 2011(08)
本文编号：3055698
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