Armored RNA技术在登革热病毒及白血病BCR-ABL1 p210/p190 融合基因检测中的应用研究

发布时间：2021-03-26 13:18

　　Armored RNA技术是近年来发展起来的一种主要用于制备RNA质控品和标准品的技术。其原理是利用基因工程手段将载有大肠杆菌MS2噬菌体衣壳蛋白的基因序列和外源性基因序列克隆到表达载体中,然后将外源性基因片段转录成RNA,并包裹在MS2衣壳蛋白基因表达的衣壳蛋白中,最终装配成球状RNA-蛋白质复合体,一般称为“盔甲RNA”（armored RNA）,或MS2病毒样颗粒（MS2 virus-like particle,MS2 VLP）。由于有外层衣壳蛋白的保护,内部的RNA片段能抵抗环境中存在的RNA酶的降解而保持稳定;同时,armored RNA整体结构又很好模拟了病毒的天然属性。所以,armored RNA技术在疾病诊断,尤其是在感染性疾病的诊断中具有很大的临床应用价值。我们前期的研究已经使用armored RNA技术成功制备了流行性感冒、埃博拉以及中东呼吸综合征等多种相关疾病病毒的armored RNAs,并在国内成功开展了这些项目核酸检测的室间质量评价（External quality assessment,EQA）。登革热是由登革热病毒引起、经伊蚊传播的一种急性传染病。登革热... 

【文章来源】：北京协和医学院北京市 211工程院校 985工程院校

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【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１－１登革热病毒基因组结构示意图??Ｆｉｇ．?１－１?Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?Ｄｅｎｇｕｅ?ｖｉｒｕｓ?ｇｅｎｏｍｅ??

（ＤＥＮＶ１？４），其基因组包括５’端非编码区、核心蛋白（Ｃ）、前体膜蛋白（Ｍ）、??包膜蛋白（Ｅ）、非结构蛋白（ＮＳ１，?ＮＳ２ａ，?ＮＳ２ｂ，ＮＳ３，?ＮＳ４ａ，?ＮＳ４ｂ?和?ＮＳ５）??［７］，登革热病毒基因结构见图１－１。??目前，荧光定量ＰＣＲ技术（ＲＴ－ｑＰＣＲ）广泛用于登革热病毒的检测和基因分??型［１０，?１２－１４］。但是，在登革热病毒核酸ＲＴ－ｑＰＣＲ检测过程中，一些影响因素，??如核酸抽提方法、检测方法、仪器类型以及操作人员等都可能引起检测结果的变??异，造成不同实验室之间检查结果缺乏可比性。另外，大多数实验室使用的??ＲＴ－ｑＰＣＲ方法没有经过准确度验证。据调查，仅１０％的实验室使用的ＲＴ－ｑＰＣＲ??方法性能良好，而超过８０％的实验室在登革热病毒ＲＴ－ｑＰＣＲ核酸检测过程中缺??乏灵敏度和特异性［１５］。值得注意的是，ＲＴ－ｑＰＣＲ技术是一种极为灵敏的检查技??术，容易受到环境中交叉污染的影响，而出现假阳性的结果；另外，登革热病毒??是一种ＲＮＡ病毒

２．１．?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＶ－ｌ￣４?重组质粒的验证??２．１．１．?ＰＣＲ?验证??目的片段进行琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪上显示的图片（图１－４）表明??ＤＥＮＶ－１？４目的片段均成功插入ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２重组质粒的ＭＣＳ２位点。??（ｂｐ）??２０００??■１０００??７５０??５００??２５０??。??图１－４?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＹ－ｌ？４目的片段ＰＣＲ验证示意图??注：Ｍ：?２，ＯＯＯｂｐＭａｒｋｅｒ；?１：?ＤＥＮＶ－１；?２：?ＤＥＮＶ－２；?３：?ＤＥＮＶ－３；?４：?ＤＥＮＶ－４；??５：?ＧＡＰＤＨ?（４９６ｂｐ）〇??Ｆｉｇ．?１－４?Ｅｔｈｉｄｉｕｍ?ｂｒｏｍｉｄｅ－ｓｔａｉｎｅｄ?１％?ａｇａｒｏｓｅ?ｇｅｌ?ｏｆ?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ??ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．??Ｎｏｔｅ：?ｔｈｅ?ＰＣＲ?ｐｒｏｄｕｃｔｓ?ｏｆ?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＶ－ｌ￣４?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ；?Ｍ：?２，０００?ｂｐ?Ｍａｒｋｅｒ；??１：?ＤＥＮＹ－１；?２：?ＤＥＮＶ－２；?３：?ＤＥＮＶ－３；?４：?ＤＥＮＶ－４；?５：?ＧＡＰＤＨ?（４９６ｂｐ）??２．１．２．测序验证??２．１．２．１．?ｐＡＣＹＣ－ＭＳ２－ＤＥＮＶ－ｌ?测序结果??■?上下游引物测序序列拼接结果与ＤＥＮＶ－１目的片段匹配??Ｓｅｑｕｅｎｃｅ?ＩＤ：?Ｑｕｅｒｙ＿１９６２０１Ｌｅｎｇｔｈ：?２８７２?Ｎｕｍｂｅｒ?ｏｆ?Ｍａｔｃｈｅｓ：?１??Ｓｃｏｒｅ?Ｅｘｐｅｃｔ?

【参考文献】：
期刊论文
[1]实时定量RT-PCR技术测定初治白血病患者常见融合基因转录子水平及其标准化的探讨[J]. 秦亚溱,李金兰,主鸿鹄,李玲娣,常艳,郝乐,阮国瑞,刘艳荣,黄晓军,陈珊珊.  中华血液学杂志. 2007(07)



本文编号：3101653