梅毒螺旋体膜蛋白Tp0971经TLR2/NF-κB诱导巨噬细胞分泌细胞因子
发布时间：2021-04-12 17:34
目的:探讨梅毒螺旋体（Treponema pallidum,Tp）膜蛋白Tp0971诱导巨噬细胞分泌细胞因子的分子机制。方法:以Tp Nichols株基因组为模板,PCR扩增Tp0971基因并构建重组质粒p ET28a（+）/Tp0971,随后将其转化至表达宿主菌E-.coli Rosseta中,IPTG诱导表达,Ni-NTA亲和层析柱纯化重组蛋白。经去除Tp0971重组蛋白中的内毒素后,将其刺激巨噬细胞,ELISA检测细胞因子IL-8、IL-1β和IL-6的分泌水平。并采用Toll样受体2（TLR2）中和抗体或TLR2 siRNA,以及核转录因子κB（NF-κB）抑制剂PDTC处理细胞,观察TLR2和NF-κB在介导细胞因子分泌中的作用。结果:成功构建p ET28a（+）/Tp0791原核表达载体,并表达出一相对分子量为29 k D的重组蛋白。ELISA结果显示,0.510μg/ml Tp0791能以剂量依赖性方式诱导巨噬细胞分泌IL-8、IL-1β和IL-6。采用siRNA沉默TLR2表达,或用TLR2中和抗体封闭后,IL-8、IL-1β和IL-6分泌明显减少...
【文章来源】：中国免疫学杂志. 2017,33(05)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
Tp0971基因的PCＲ扩增与重组载体的酶切鉴定Fig．1PCＲamplificationofTp0971geneandenzyme
图1B)。2.2Tp0971诱导表达和鉴定Tp0971重组表达图1Tp0971基因的PCＲ扩增与重组载体的酶切鉴定Fig．1PCＲamplificationofTp0971geneandenzymedigestionofrecombinantvectorNote:A.ElectrophoreticanalysisofTp0971PCＲproductin1%agarosegel.1.DNAmarker;2.PCＲproduct;3.Negativecontrol;B.ＲestrictionmappingofrecombinantplasmidpET28a(+)/Tp0971digestedwithBamHⅠandHindⅢ.1，4.DNAmarker;2.PCＲproduct;3.ＲecombinantplasmidpET28a(+)/Tp0971digestedwithBamHⅠandHindⅢ.体分别加入不同浓度IPTG诱导表达，图2显示，37℃下蛋白为可溶性表达，但加入0.2～1.5mmol/LIPTG对Tp0971表达无明显影响。2.3重组蛋白的鉴定Tp0971表达产物经SDS-PAGE后，加入TBST稀释后的6-His-Tag单抗为一抗，采用Westernblot方法鉴定表达产物，结果显示在29kD初可见明显的条带，而对照组无相应条带(图3)。2.4重组蛋白的纯化重组菌用B-PEＲ裂解并经Ni-NTA过柱后，用Buffer1、Buffer2以及Eluent进行洗脱。SDS-PAGE结果显示Buffer2能洗脱所有杂蛋白，而最终Eluent洗脱后产物得到了进一步纯化(图4)。2.5Tp0971蛋白对巨噬细胞分泌细胞因子的影响因CD11b和CD36是巨噬细胞表面的特征性分子，因此我们在Tp0971蛋白刺激巨噬细胞之前，采用Westernblot检测了PMA处理THP-1细胞前后细胞膜上CD11b和CD36表达的变化。结果显示，未经PMA处理的THP-1细胞表面CD11b和CD36表达水平低下，经160nmol/LPMA诱导后，细胞膜上CD11b和CD36明显增高，而内参Gα蛋白保持恒定(图5)，表明THP-1成功诱导为巨噬细胞。此外，未经蛋白刺激的巨噬细胞细胞因子分泌水平很低。而用不同浓度Tp0971蛋白刺激后24h后，细胞上清中IL-8、IL-1β和IL-6水平显著增高(表1)。为排除?
图3Tp0971重组蛋白的Westernblot鉴定Fig．3WesternblotidentificationofTp0971recombin-antproteinNote:Lane1.pET28a(+)/Tp0971recombinantprotein;Lane2.Purificatedrecombinationprotein;Lane3.ExpressionbacteriawithpET28a(+).图4Tp0971重组蛋白纯化效果Fig．4PurificationeffectofTp0971recombinantproteinNote:Lane1.SupernatantofbrokenTp0971recombinantprotein;Lane2.Celllysateflow-through;Lane3.Buffer1washedprotein;Lane4.Buffer2washedprotein;Lane5.Buffereluatedprotein;Lane6.Proteinmarker.图5PMA诱导THP-1细胞表达CD11b和CD36Fig．5PMAinducesTHP-1cellsexpressionofCD11bandCD36表1不同浓度Tp0971对细胞因子分泌的影响Tab.1EffectsofdifferentconcentrationsofTp0971onsecretionofcytokinesGroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971(0.1mmol/kg)30.7±7.31)46.2±7.51)32.5±4.41)Tp0971(1.0mmol/kg)85.1±6.21)147.9±18.61)163.8±14.51)Tp0971(5.0μg/ml)113.5±5.51)251.3±5.01)209.4±5.61)Tp0971(10.0μg/ml)131.6±10.61)272.5±6.71)212.6±10.21)Note:1)P＜0.05，ascomparedwiththecontrolgroup.图6TLＲ2siＲNA干扰效果Fig．6SilenceofTLＲ2expressionbysiＲNA图7Tp0971或TLＲ2抗体对细胞核中p65含量的影响Fig．7EffectofTp0971orTLＲ2antibodyoncontentofp65innucleus表2抑制TLＲ2和NF-κB对巨噬细胞分泌细胞因子的影响Tab.2InhibitionofTLＲ2andNF-κBonsecretionofcytokinesinmacrophagesGroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971131.6±10.61)
【参考文献】：
期刊论文
[1]Molecular cloning of virB12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector[J]. Shiva Mirkalantari,Nour Amirmozafari,Bahram Kazemi,Gholamreza Irajian. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2012(07)
[2]梅毒螺旋体Tp0971重组蛋白的表达及其在梅毒血清学诊断中的初步评价[J]. 曾铁兵,刘小军,张跃军,刘双全,裴瑞青,赵飞骏,吴移谋. 中国病原生物学杂志. 2010(06)
本文编号：3133697
【文章来源】：中国免疫学杂志. 2017,33(05)北大核心CSCD
【文章页数】：5 页
【部分图文】：
Tp0971基因的PCＲ扩增与重组载体的酶切鉴定Fig．1PCＲamplificationofTp0971geneandenzyme
图1B)。2.2Tp0971诱导表达和鉴定Tp0971重组表达图1Tp0971基因的PCＲ扩增与重组载体的酶切鉴定Fig．1PCＲamplificationofTp0971geneandenzymedigestionofrecombinantvectorNote:A.ElectrophoreticanalysisofTp0971PCＲproductin1%agarosegel.1.DNAmarker;2.PCＲproduct;3.Negativecontrol;B.ＲestrictionmappingofrecombinantplasmidpET28a(+)/Tp0971digestedwithBamHⅠandHindⅢ.1，4.DNAmarker;2.PCＲproduct;3.ＲecombinantplasmidpET28a(+)/Tp0971digestedwithBamHⅠandHindⅢ.体分别加入不同浓度IPTG诱导表达，图2显示，37℃下蛋白为可溶性表达，但加入0.2～1.5mmol/LIPTG对Tp0971表达无明显影响。2.3重组蛋白的鉴定Tp0971表达产物经SDS-PAGE后，加入TBST稀释后的6-His-Tag单抗为一抗，采用Westernblot方法鉴定表达产物，结果显示在29kD初可见明显的条带，而对照组无相应条带(图3)。2.4重组蛋白的纯化重组菌用B-PEＲ裂解并经Ni-NTA过柱后，用Buffer1、Buffer2以及Eluent进行洗脱。SDS-PAGE结果显示Buffer2能洗脱所有杂蛋白，而最终Eluent洗脱后产物得到了进一步纯化(图4)。2.5Tp0971蛋白对巨噬细胞分泌细胞因子的影响因CD11b和CD36是巨噬细胞表面的特征性分子，因此我们在Tp0971蛋白刺激巨噬细胞之前，采用Westernblot检测了PMA处理THP-1细胞前后细胞膜上CD11b和CD36表达的变化。结果显示，未经PMA处理的THP-1细胞表面CD11b和CD36表达水平低下，经160nmol/LPMA诱导后，细胞膜上CD11b和CD36明显增高，而内参Gα蛋白保持恒定(图5)，表明THP-1成功诱导为巨噬细胞。此外，未经蛋白刺激的巨噬细胞细胞因子分泌水平很低。而用不同浓度Tp0971蛋白刺激后24h后，细胞上清中IL-8、IL-1β和IL-6水平显著增高(表1)。为排除?
图3Tp0971重组蛋白的Westernblot鉴定Fig．3WesternblotidentificationofTp0971recombin-antproteinNote:Lane1.pET28a(+)/Tp0971recombinantprotein;Lane2.Purificatedrecombinationprotein;Lane3.ExpressionbacteriawithpET28a(+).图4Tp0971重组蛋白纯化效果Fig．4PurificationeffectofTp0971recombinantproteinNote:Lane1.SupernatantofbrokenTp0971recombinantprotein;Lane2.Celllysateflow-through;Lane3.Buffer1washedprotein;Lane4.Buffer2washedprotein;Lane5.Buffereluatedprotein;Lane6.Proteinmarker.图5PMA诱导THP-1细胞表达CD11b和CD36Fig．5PMAinducesTHP-1cellsexpressionofCD11bandCD36表1不同浓度Tp0971对细胞因子分泌的影响Tab.1EffectsofdifferentconcentrationsofTp0971onsecretionofcytokinesGroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971(0.1mmol/kg)30.7±7.31)46.2±7.51)32.5±4.41)Tp0971(1.0mmol/kg)85.1±6.21)147.9±18.61)163.8±14.51)Tp0971(5.0μg/ml)113.5±5.51)251.3±5.01)209.4±5.61)Tp0971(10.0μg/ml)131.6±10.61)272.5±6.71)212.6±10.21)Note:1)P＜0.05，ascomparedwiththecontrolgroup.图6TLＲ2siＲNA干扰效果Fig．6SilenceofTLＲ2expressionbysiＲNA图7Tp0971或TLＲ2抗体对细胞核中p65含量的影响Fig．7EffectofTp0971orTLＲ2antibodyoncontentofp65innucleus表2抑制TLＲ2和NF-κB对巨噬细胞分泌细胞因子的影响Tab.2InhibitionofTLＲ2andNF-κBonsecretionofcytokinesinmacrophagesGroupsIL-8(ng/ml)IL-6(ng/ml)IL-1β(pg/ml)Control9.6±5.215.5±8.122.3±5.2Tp0971131.6±10.61)
【参考文献】：
期刊论文
[1]Molecular cloning of virB12 gene of Brucella melitensis 16M strain in pET28a vector[J]. Shiva Mirkalantari,Nour Amirmozafari,Bahram Kazemi,Gholamreza Irajian. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine. 2012(07)
[2]梅毒螺旋体Tp0971重组蛋白的表达及其在梅毒血清学诊断中的初步评价[J]. 曾铁兵,刘小军,张跃军,刘双全,裴瑞青,赵飞骏,吴移谋. 中国病原生物学杂志. 2010(06)
本文编号：3133697
本文链接：https://www.wllwen.com/linchuangyixuelunwen/3133697.html
最近更新
教材专著
