核酸现场检测关键技术研究及初步应用

发布时间：2021-05-21 05:26

　　癌症和传染性疾病等仍为人类健康生活的严重威胁,而相关的生物标志物的快速、准确检测是有效应对的前提。蛋白和核酸标志物是当前体外诊断的主要目标分子,而针对蛋白检测的免疫技术一般敏感性较差,故核酸分子靶标为对象的检测技术成为主流。核酸检测中成熟的PCR及其衍生技术因严格的温控和精密仪器等需求而限制了应用场景。而以环介导恒温扩增（LAMP）为代表的新技术具有简便、快速、高特异性和高灵敏性的优势。然而,LAMP等恒温扩增技术引物设计复杂并受到严格专利保护,制约了真正的应用。同时,微流控芯片的流体精准操控及规模化集成优势可将核酸检测步骤高度集成,将明显降低人工操作步骤、缩短检测时间,其固有的微型化优势亦使得便携式现场多靶标高通量的核酸分析成为可能。本研究以基于微流控芯片的多重多靶标核酸检测和新型核酸恒温扩增技术的研发为核心,结合快速样品前处理技术基本完成了现场核酸检测关键技术体系的构建。主要内容及结果如下:（1）以微流控芯片为核心,构建了基于LAMP技术的多重多靶可视化及荧光核酸的现场核酸检测平台,实现了应用于疟疾疫情防控的6指标同时检测可视化芯片研发及应用于中东呼吸道综合征病毒（MERS-CoV... 

【文章来源】：中国科学院大学(中国科学院过程工程研究所)北京市

【文章页数】：171 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第1章 引言
    1.1 生物标志物检测概述
    1.2 核酸分析技术进展
        1.2.1 变温核酸扩增技术
        1.2.2 恒温核酸扩增技术
    1.3 微型化核酸检测技术
        1.3.1 现场检测技术概述
        1.3.2 基于微流控芯片的核酸检测
        1.3.3 纸基核酸检测技术
    1.4 本论文的选题依据及研究内容
        1.4.1 选题依据及意义
        1.4.2 研究内容
第2章 多重可视化微流控LAMP的疟疾传播检测应用
    2.1 研究背景
    2.2 实验部分
        2.2.1 实验材料与药品
        2.2.2 实验仪器
        2.2.3 六种目标的保守靶序列选择和LAMP引物设计筛选
        2.2.4 LAMP反应体系
        2.2.5 蚊子及疟原虫核酸提取
        2.2.6 可视化mμLAMP阵列检测
        2.2.7 凝胶电泳实验
        2.2.8 统计学分析
    2.3 结果与讨论
        2.3.1 六种目标的特异性基因选择和LAMP引物设计筛选
        2.3.2 六种目标的检测敏感性评价
        2.3.3 可视化LAMP反应的体积影响
        2.3.4 基于mμLAMP的六靶标同时检测验证
        2.3.5 基于mμLAMP的六靶标特异性验证
        2.3.6 基于mμLAMP的不同蚊媒检测评价
    2.4 本章小结
第3章 MERS-CoV多重微流控荧光LAMP检测系统
    3.1 研究背景
    3.2 实验部分
        3.2.1 实验材料与药品
        3.2.2 实验仪器
        3.2.3 四段基因人工质粒的构建及DNA模板的制备
        3.2.4 四段基因的体外转录RNA制备
        3.2.5 LAMP及逆转录LAMP反应体系
        3.2.6 四段基因的LAMP引物设计筛选
        3.2.7 四组LAMP引物的敏感性分析
        3.2.8 LAMP及逆转录LAMP常温储存试剂制备
        3.2.9 微流控荧光LAMP检测
    3.3 结果与讨论
        3.3.1 四段MERS-CoV序列的LAMP引物设计筛选
        3.3.2 四段MERS-CoV的引物对于RNA的敏感性评价
        3.3.3 基于Orfla区段引物的常温检测试剂效果评价
        3.3.4 MERS-CoV多重微流控荧光LAMP检测系统的初步应用
    3.4 本章小结
第4章 基于竞争性互补配对的核酸恒温扩增(CAMP)新方法
    4.1 研究背景
    4.2 实验部分
        4.2.1 实验材料与药品
        4.2.2 实验仪器
        4.2.3 MERS-CoV的orf1a基因改造及CAMP引物设计
        4.2.4 Mo1a基因的体外转录RNA制备
        4.2.5 CAMP及其衍生反应体系
        4.2.6 Mo1a基因的CAMP及衍生反应产物的限制性内切酶分析
        4.2.7 琼脂糖凝胶电泳
        4.2.8 Mo1a基因的CAMP反应灵敏度分析
    4.3 结果与讨论
        4.3.1 CAMP反应体系与原理
        4.3.2 CAMP引物设计推荐规则
        4.3.3 CAMP对DNA扩增反应验证
        4.3.4 逆转录CAMP对RNA扩增反应验证
        4.3.5 CAMP反应中外引物及环引物的作用
        4.3.6 CAMP及其衍生反应的产物分析
        4.3.7 CAMP反应灵敏度测试
        4.3.8 CAMP反应判定
        4.3.9 CAMP与LAMP技术的比较
    4.4 本章小结
第5章 CAMP反应体系优化
    5.1 研究背景
    5.2 实验部分
        5.2.1 实验材料与药品
        5.2.2 实验仪器
        5.2.3 CAMP引物及模板
        5.2.4 CAMP及其衍生反应体系
    5.3 结果与讨论
        5.3.1 甜菜碱浓度优化
        5.3.2 镁离子浓度的优化
        5.3.3 甘油浓度的优化
        5.3.4 聚乙二醇浓度的优化
        5.3.5 二甲亚砜浓度的优化
        5.3.6 甲酰胺浓度的优化
        5.3.7 引物体系优化筛选
        5.3.8 应用于CAMP的荧光染料筛选
        5.3.9 Taqman探针应用于CAMP反应
    5.4 本章小结
第6章 CAMP在甲型H1N1病毒检测中的应用
    6.1 研究背景
    6.2 实验部分
        6.2.1 实验材料与药品
        6.2.2 实验仪器
        6.2.3 H1及N1基因改造及CAMP引物设计
        6.2.4 H1和N1基因的体外转录RNA制备
        6.2.5 标准CAMP及衍生反应
        6.2.6 甲型流感病毒样本核酸提取及转录
        6.2.7 H1和N1的CAMP引物敏感性分析
        6.2.8 H1和N1的CAMP引物对于真实样本检测
    6.3 结果与讨论
        6.3.1 H1及N1基因的CAMP引物筛选
        6.3.2 H1及N1基因的CAMP加速引物筛选
        6.3.3 H1及N1基因的CAMP引物的可视化检测
        6.3.4 H1及N1基因DNA的CAMP检测敏感性
        6.3.5 H1及N1基因RNA的CAMP检测敏感性测试
        6.3.6 H1及N1基因CAMP引物的特异性验证
        6.3.7 H1及N1基因CAMP检测的统计学分析
    6.4 本章小结
第7章 CAMP在犬病毒检测中的应用
    7.1 研究背景
    7.2 实验部分
        7.2.1 实验材料与药品
        7.2.2 实验仪器
        7.2.3 八种犬病毒CAMP引物设计筛选
        7.2.4 犬病毒基因组提取
    7.3 结果与讨论
        7.3.1 八种犬感染病毒CAMP引物筛选
        7.3.2 八种犬感染病毒基因的CAMP加速引物筛选
        7.3.3 四种犬病毒实际检测
    7.4 本章小结
第8章 针对CAMP技术的核酸快速提取
    8.1 研究背景
    8.2 实验部分
        8.2.1 实验材料与药品
        8.2.2 实验仪器
        8.2.3 标准OL-CAMP反应及PCR反应
        8.2.4 简易核酸提取装置及使用
        8.2.5 琼脂糖凝胶电泳分析
    8.3 结果与讨论
        8.3.1 碱浓度核酸提取的影响
        8.3.2 细菌快速提取核酸CAMP反应评价
        8.3.3 金黄色葡萄球菌提取效果评价
        8.3.4 病毒提取效果评价
    8.4 本章小结
第9章 基于微流控CAMP的鲤科鱼疱疹病毒现场检测
    9.1 研究背景
    9.2 实验部分
        9.2.1 实验材料与药品
        9.2.2 实验仪器
        9.2.3 病鱼样本核酸提取
        9.2.4 CyHV-2及CyHV-3的CAMP引物筛选及设计
        9.2.5 标准CAMP及衍生反应
        9.2.6 CyHV-2及CyHV-3的CAMP引物敏感性分析
        9.2.7 CyHV-2及CyHV-3的微流控CAMP检测
    9.3 结果与讨论
        9.3.1 CyHV-2和CyHV-3的CAMP引物筛选
        9.3.2 CyHV-2和CyHV-3的CAMP加速引物筛选
        9.3.3 CyHV-2和CyHV-3的OL-CAMP引物敏感性
        9.3.4 CyHV-2和CyHV-3的OL-CAMP微流控芯片检测
    9.4 本章小结
第10章 基于螺旋环的核酸恒温扩增(HAMP)新方法
    10.1 研究背景
    10.2 实验部分
        10.2.1 实验材料与药品
        10.2.2 实验仪器
        10.2.3 MERS-CoV orf1b的HAMP引物设计
        10.2.4 Mo1b基因的体外转录RNA的制备
        10.2.5 HAMP及其衍生反应体系
        10.2.6 Mo1b基因的HAMP及衍生反应产物的限制性内切酶分析
        10.2.7 琼脂糖凝胶电泳分析
        10.2.8 Mo1b基因的HAMP反应灵敏度分析
    10.3 结果与讨论
        10.3.1 HAMP与PSR反应原理及比较
        10.3.2 HAMP引物设计推荐规则
        10.3.3 HAMP对DNA扩增反应验证
        10.3.4 HAMP反应灵敏度测试
        10.3.5 AHAMP反应灵敏度测试
        10.3.6 RT-AHAMP反应灵敏度测试
        10.3.7 HAMP及AHAMP的产物分析
        10.3.8 AHAMP及RT-AHAMP的可视化检测
    10.4 本章小结
第11章 结论与展望
    11.1 主要结论
    11.2 主要创新点
    11.3 后期建议
参考文献
致谢
作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果



本文编号：3199136