表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺脏炎症反应的调节作用及机制研究

发布时间：2021-05-23 00:16

　　目的:动态观察脓毒症相关急性肺损伤病程演变特点,评价表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤的作用并探讨潜在作用机制,为临床治疗急性肺损伤探索新的治疗策略。研究方法:实验第一部分:腹腔注射脂多糖（LPS）制备小鼠脓毒症相关急性肺损伤模型,通过评价小鼠一般状态、体重、肺部病理学、肺泡毛细血管屏障功能和肺脏炎症等指标,确认模型建立成功。动态观察脓毒症相关急性肺损伤小鼠在疾病不同阶段（6h、24h和72h）肺部炎症损伤的演变特点。光镜下观察小鼠肺组织HE染色切片,通过肺损伤评分系统评价肺组织学损伤的程度;通过BCA法检测肺泡灌洗液中总蛋白浓度和小鼠肺组织湿/干重比值反映肺泡毛细血管屏障功能改变;通过检测小鼠肺泡灌洗液中中性粒细胞计数,ELISA法检测肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）浓度评价肺部炎症反应情况。第二部分:以第一部分模型方法制备脓毒症相关急性肺损伤模型,探讨表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤的作用。将32只实验小鼠分成4组:对照组（8只）,表儿茶素（EC）对照组（8只）,模型组（8只）,表儿茶素（EC）治疗组（8只）。对照组小鼠腹腔注射5ml/kg生理盐水,半小时后鼻饲生理盐水5ml/... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：98 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分 脓毒症相关急性肺损伤小鼠模型的建立及演变特点
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 药物溶液配制
        2.2 研究对象和分组
            2.2.1 研究对象
            2.2.2 LPS诱导小鼠脓毒症相关急性肺损伤模型的建立及分组
        2.3 小鼠肺组织病理学变化及肺损伤评分
        2.4 小鼠支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数测定
        2.5 小鼠肺湿/干重比值测定
        2.6 小鼠支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度测定
        2.7 支气管肺泡灌洗液中TNF-α浓度测定
        2.8 统计学分析
    3 结果
        3.1 LPS诱导脓毒症相关急性肺损伤小鼠一般状态、体重变化
        3.2 LPS诱导脓毒症相关急性肺损伤小鼠病理学改变和肺损伤评分
        3.3 LPS诱导脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺泡毛细血管屏障功能的改变
            3.3.1 支气管肺泡灌洗液总蛋白浓度测定
            3.3.2 肺湿/干比重(W/D)测定
        3.4 LPS诱导脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺脏炎症的改变
            3.4.1 支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数表达变化
            3.4.2 支气管肺泡灌洗液中炎症因子TNF-α表达变化
    4 讨论
    5 结论
第二部分 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤的保护性作用
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
            2.1.3 实验溶液配制
        2.2 研究对象和分组
            2.2.1 研究对象
            2.2.2 脓毒症相关急性肺损伤小鼠模型的建立及分组
        2.3 小鼠肺组织病理学变化及肺损伤评分
        2.4 小鼠支气管肺泡灌洗液中性粒细胞计数测定
        2.5 小鼠肺湿/干重比测定
        2.6 小鼠支气管肺泡灌洗液中总蛋白浓度测定
        2.7 小鼠RAW264.7细胞培养
        2.8 RAW264.7细胞活性检测
            2.8.1 实验分组
            2.8.2 细胞培养
            2.8.3 药物处理
            2.8.4 CCK8细胞活性检测
        2.9 培养基上清中TNF-α、IL-6及NO表达水平测定
            2.9.1 培养基上清中TNF-α及NO表达水平测定
            2.9.2 培养基上清中IL-6表达水平测定
        2.10 数据统计
    3 结果
        3.1 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺脏病理学改变的影响
        3.2 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺泡毛细血管屏障能力的影响
            3.2.1 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠支气管肺泡灌洗液总蛋白浓度的影响
            3.2.2 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺湿/干比重(W/D)的影响
        3.3 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺脏炎症反应的影响
        3.4 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠体重及生存率的影响
        3.5 RAW264.7细胞细胞活力检测
        3.6 表儿茶素对LPS诱导下RAW264.7细胞生成TNF-α的影响及量效关系
        3.7 表儿茶素对LPS诱导下RAW264.7细胞生成NO的影响及量效关系
        3.8 表儿茶素对LPS诱导下RAW264.7细胞生成IL-6的影响
    4 讨论
    5 结论
第三部分 表儿茶素通过P38MAPK信号通路调节脓毒症相关急性肺损伤炎症反应的机制研究
    1 前言
    2 材料与方法
        2.1 主要试剂和仪器
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 主要仪器
        2.2 研究对象和分组
            2.2.1 研究对象
            2.2.2 脓毒症相关急性肺损伤小鼠模型的建立及分组
        2.3 脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺组织基因检测
            2.3.1 样品破碎匀浆
            2.3.2 总RNA提取及DNA消化
            2.3.3 RNA定量
            2.3.4 cDNA合成
            2.3.5 实时荧光定量PCR
        2.4 Westernblot检测肺组织中蛋白表达情况
            2.4.1 小鼠肺组织总蛋白样品的制备
            2.4.2 蛋白浓度测定
            2.4.3 配胶
            2.4.4 目的蛋白的电泳和分离
            2.4.5 转膜、封闭、孵育及显影
        2.5 P38蛋白构建及药效团分析
            2.5.1 蛋白晶体结构总结
            2.5.2 准备蛋白
            2.5.3 构建药效团
            2.5.4 蛋白4L8M和表儿茶素分子对接评分
        2.6 P38蛋白激酶活性检测
    3 结果
        3.1 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺组织基因表达的影响
        3.2 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺组织P38及磷酸化P38蛋白表达的影响
        3.3 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺组织JNK、ERK1/2及磷酸化JNK、ERK1/2蛋白表达的影响
        3.4 表儿茶素对脓毒症相关急性肺损伤小鼠肺组织c-Jun及磷酸化c-Jun蛋白表达的影响
        3.5 P38α蛋白构建及药效团分析
            3.5.1 P38α蛋白三维结构及作用方式
            3.5.2 P38α蛋白药效团分析结果
            3.5.3 表儿茶素与Pharmacophore_04分子对接结果
            3.5.4 以转录因子ATF2为底物检测表儿茶素对P38α蛋白激酶的抑制作用
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历


【参考文献】：
期刊论文
[1]Activation and signaling of the p38 MAP kinase pathway[J]. Tyler ZARUBIN.  Cell Research. 2005(01)



本文编号：3201919