胞内分枝杆菌ELISA检测试剂盒的研制

发布时间：2021-05-24 12:17

　　肝素结合血凝素（HBHA）是分枝杆菌分泌的一种黏附素,它是由致病性分枝杆菌产生的一种糖蛋白,肺外播散性结核重要毒力因素之一。HBHA在胞内分枝杆菌免疫诊断、治疗和预防方面的应用研究起重要意义。本文将构建好的pET-32a-HBHA质粒转入到BL21（DE3）中,在诱导剂IPTG作用下表达HBHA蛋白。经组氨酸镍柱纯化浓缩,SDS-PAGE电泳鉴定,获得约38 kDa大小,浓度为1.6 mg/ml的HBHA蛋白。应用单克隆抗体技术,以纯化的胞内分枝杆菌HBHA蛋白为免疫抗原制备抗胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体,得到三株细胞上清效价为1:1600的细胞株,体内扩大培养后,获得大量效价为2.56×10⁵的抗体。并以HBHA单克隆抗体作为包被抗体建立胞内分枝杆菌ELISA检测方法。应用棋盘法优化检测条件,同时试验对封闭液进行了最佳选择,对检测样品的特异性、敏感性和准确度进行评估,评估结果显示,该法对其他抗原均无交叉反应,有良好的特异性,能检测菌体浓度为200个/ml,具有良好的敏感性,检测准确度高达93.3%,并成功组装试剂盒。该试剂盒对家畜胞内分枝杆菌病的诊断和防治具有... 

【文章来源】：长春理工大学吉林省

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 前言
    1.2 非结核分枝杆菌实验室检测方法
        1.2.1 细菌学鉴定分枝杆菌
        1.2.2 分子生物学鉴定分枝杆菌
    1.3 黏附素
        1.3.1 肝素结合血凝素
        1.3.2 HBHA结构与功能
    1.4 HBHA研究进展
    1.5 酶联免疫吸附法
    1.6 研究目的及意义
第二章 胞内分枝杆菌HBHA原核表达及蛋白纯化
    2.1 试验材料
        2.1.1 仪器及药品
        2.1.2 主要试剂配制
    2.2 试验内容
        2.2.1 菌体的活化
        2.2.2 pET-32a-HBHA质粒转化
        2.2.3 菌体扩大诱导
        2.2.4 HBHA蛋白纯化及浓度测定
    2.3 试验结果
        2.3.1 胞内分枝杆菌HBHA蛋白纯化
        2.3.2 胞内分枝杆菌HBHA蛋白浓度测定
    2.4 小结
第三章 胞内分枝杆菌HBHA单克隆抗体的制备
    3.1 试验材料
        3.1.1 仪器及药品
        3.1.2 试剂
    3.2 试验方法
        3.2.1 BaLB/C鼠免疫
        3.2.2 骨髓瘤细胞的准备
        3.2.3 饲养细胞的准备
        3.2.4 杂交瘤细胞融合
        3.2.5 杂交瘤细胞株筛选
        3.2.6 杂交瘤细胞的克隆化培养
        3.2.7 杂交瘤细胞的冻存与复苏
        3.2.8 单克隆抗体大量制备
        3.2.9 单克隆抗体效价测定
    3.3 试验结果
        3.3.1 小鼠免疫
        3.3.2 杂交瘤细胞株建立
    3.4 小结
第四章 胞内分枝杆菌抗鼠全血清的制备
    4.1 试验材料
    4.2 试验方法
        4.2.1 胞内分枝杆菌的复苏
        4.2.2 胞内分枝杆菌抗血清的制备
    4.3 试验结果
        4.3.1 胞内分枝杆菌抗鼠血清的制备
    4.4 小结
第五章 胞内分枝杆菌ELISA检测方法的建立及初步应用
    5.1 试验材料
        5.1.1 仪器及药品
        5.1.2 试剂
    5.2 试验方法
        5.2.1 胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法的建立
        5.2.2 检测条件优化
        5.2.3 特异性试验
        5.2.4 敏感性试验
        5.2.5 准确度试验
    5.3 试验结果
        5.3.1 胞内分枝杆菌双抗夹心ELISA检测方法的建立
        5.3.2 单克隆抗体包被最佳浓度与抗鼠血清最佳浓度的确定
        5.3.3 最佳封闭液的确定
        5.3.4 特异性试验
        5.3.5 敏感性试验
        5.3.6 准确度检测
        5.3.7 待测样品检测
    5.4 小结
第六章 胞内分枝杆菌ELISA检测试剂盒的组装
    6.1 试剂盒特点
    6.2 胞内分枝杆菌ELISA检测试剂盒使用说明书
结论
致谢
参考文献
附录


【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3204181